Immunfärgning av biocytin fyllda och bearbetade Sektioner neurokemiska markörer

Summary

Detta protokoll presenterar en metod för den morfologiska återvinning av nervceller lappade under elektrofysiologiska inspelningar med biocytin fyllning och efterföljande immunhistokemisk efterbearbetning. Vi visar att tjocka biocytin fyllda sektioner som färgats och täck kan restained med andra primära dagar eller månader antikropps senare.

Abstract

Elektrofysiologiska inspelningar av celler med patch clamp-tekniken har gjort det möjligt att identifiera olika neuronala typer som baseras på bränning mönster. Införandet av biocytin / neurobiotin i inspelningen elektroden tillåter post-hoc återhämtning av morfologiska detaljer som är nödvändiga för att bestämma den dendritiska arborization och regionerna som omfattas av axoner i de inspelade nervceller. Men med tanke på förekomsten av morfologiskt liknande nervceller med olika neurokemiska identiteter och funktioner, immunhistokemisk färgning för cell-typspecifika proteiner är viktigt att slutgiltigt identifiera neuroner. Att förbli ansluten till nätet, är hjärnsektioner för fysiologiska inspelningar beredd med en tjocklek av 300 pm eller större. Men hindrar denna tjocklek ofta immunhistologisk efterbearbetning på grund av problem med penetrations antikropp, vilket nödvändiggör resektion av vävnad. Resektion av skivor är en utmanande konst, ofta Resulting i förlust av vävnad och morfologi av celler från vilka elektro data erhölls, vilket gör data oanvändbara. Eftersom återvinning av morfologi skulle begränsa dataförlust och guide i valet av neuronala markörer, har vi antagit en strategi för att återhämta sig cellmorfologi först, följt av sekundär immunfärgning. Vi introducerar ett praktiskt förhållningssätt till biocytin fylla under fysiologiska inspelningar och efterföljande serienummer immunfärgning för återvinning av morfologi, följt av restaining sektioner för att bestämma neurokemiska identiteten. Vi rapporterar att sektioner som fylldes med biocytin, fixerade med paraformaldehyd (PFA), färgade, och täck kan tas bort och restained med andra primära dagar antikropps senare. Denna restaining innebär avlägsnande av täckglaset, tvättningen av sektionerna i en buffertlösning, och inkubationen av primära och sekundära antikroppar för att avslöja den neurokemiska identiteten. Metoden är fördelaktig för att eliminera daten förlust på grund av en oförmåga att återhämta sig morfologi och för att minska ner de neurokemiska markörer som skall testas baserat på morfologi.

Introduction

Hjärnan är känd för mångfalden i de strukturella och funktionella egenskaper hos de enskilda neuronala element. Förstå roller distinkta neuronala typer i hjärnans funktion och patologi kräver karakterisering och otvetydig identifiering av nervceller. Strukturellt morfologiska särdrag som definieras av somato-dendritiska plats bestämma de potentiella ingångar som en viss neuron tar emot, medan mönstret av axonal arborization identifierar potentiella postsynaptiska mål. Den strukturella mångfalden av nervceller har uppskattats ända sedan Ramón y Cajal s banbrytande histologiska studier ^1. Tillkomsten av encelliga inspelningsteknik visade att strukturellt distinkta nervceller visar också skillnader i bränning mönster och synaptiska egenskaper. Mångfalden i struktur och fysiologi är särskilt tydligt i GABAergic hämmande nervceller ^2,3. Dessutom har det blivit alltmer uppenbart att structurally liknande neuroner kan uttrycka olika neurokemiska markörer och visa motsvarande funktionella skillnader ^4. På samma sätt kan nervceller med samma neurokemiska markörer har olika strukturer och funktioner ^5-10. Således, i praktiken, analysen av de funktionella egenskaperna av nervceller och deras roll i nätverket innebär att definiera både morfologiska och neurokemiska identiteter. Även med tillkomsten av reporter mus linjer riktade mot särskilda neurokemiska markörer, är det ofta nödvändigt att bestämma morfologi och subtyp identitet baserad på immunhistologi ^11.

Standardmetoden används för att karakterisera celler som spelats in akut hjärnan skivor är att fylla dem med biocytin eller neurobiotin under inspelningen, fixa avsnitten i paraformaldehyd (PFA) efter inspelningarna, och använda immunohistokemi att avslöja morfologi och neurokemi. Eftersom tjockleken av sektioner för skiva fysiologi är typiskt 300 umeller mer, och eftersom de flesta antikroppar misslyckas att penetrera hela vägen genom det djup, skivorna måste återsektioneras till 60 pm eller mindre för att möjliggöra samtidig immunfärgning för biocytin och neurokemiska markörer ^12-14. Tyvärr är resektion mödosam; riskerar förlust av vävnad under snittning; och kan leda till differential vävnad krympning, vilket komplicerar morfologiska rekonstruktioner. Dessutom, tidigare kunskap om morfologi kunde hjälpa begränsa kandidatmarkörer som sannolikt kommer att uttryckas av cellerna. Vi har ändrat standard biocytin immunhistologi protokoll för att möjliggöra serie behandling av avsnitten först för återvinning av morfologi och sedan för identifiering av potentiella neurokemiska markörer.

Immunohistokemi är studiet av antigendistributionen i vävnader eller celler och kan visualiseras med användning av ett enzym, fluorescerande markörer, radioaktiva element, eller guld kolloidpartiklarna ^15. Förfarandet involves använder primära antikroppar för att specifikt märka och amplifiera en eller flera specifika antigener, följt av användning av fluorescerande sekundära antikroppar riktade mot den primära antikroppen för visualisering. På grund av behovet att skilja fluorescensspektra för varje sekundär antikropp utan överlappning, kan endast ett begränsat antal antigener undersökas samtidigt. Således kan förkunskaper i morfologi vara användbar vid val kandidatneurokemiska markörer för cellklassificering. Begreppsmässigt är logiken bakom serie bearbetning av redan färgade snitt baserat på antagandet att immunmärkningen för ett protein eller en peptid inte bör störa antigenicitet och efterföljande immunomärkning för en strukturellt oberoende peptid ^16. Denna avsaknad av interferens beror på bindning av antikroppar till ett specifikt protein epitop på ett antigen och således medger samtidig färgning av multipla antigener i samma vävnad. Antalet antigener Revealed genom immunfärgning är begränsad av behovet av icke-överlappande spektra för de fluorescerande sekundära antikroppar och av behovet av att rikta individuella antigener med antikroppar framkallade i olika arter för att eliminera korsreaktivitet ^17,18. Även om detta är resonemanget bakom serie snarare än samtidig märkning med två distinkta antikroppar som kan interagera, så vitt vi vet, immunfärgning för en andra antigen har inte rapporterats efter avslutad immunmärkningen för en eller flera antigener på monterade sektioner. Här beskriver vi en metod för seriell immunofärgning av tidigare färgats och monterade sektioner. Medan vi detalj denna process för en serie immunomärkning förfarande för indrivning av morfologi följt av färgning för protein / peptidmarkörer i tjocka sektioner, kan på samma sätt användas i standard, tunna histologiska sektioner också. Dessutom beskriver vi ett praktiskt tillvägagångssätt för att fylla inspelade nervceller med biocytin och processen för att lossaelektroden från cellen efter slutförandet av inspelningar för att optimera fyllningen av axonal och dendritiska hållare av nervceller, som presenteras i vår senaste arbete ^6,8.

Den mest avgörande fördelen med det förfarande som beskrivs här är att morfologin av det inspelade cellen kan återhämtat sig helt och avbildas innan du resektion eller immunostain skivorna. Även problem med penetrationen av vissa antikroppar kan göra det nödvändigt att resektion skivor för sekundär immunfärgning, skulle de förfaranden som anges här eliminerar behovet av att rekonstruera komplexa neuroner från flera avsnitt och skulle undvika problem på grund av förlust vävnad och olika krympning, som kan äventyra rekonstruktion följande resektion. En extra fördel är att processen kommer att minska kostnader, tid, ansträngning, och dyra antikroppar genom att begränsa immunfärgning och återsnittning till segment i vilka biocytin fyllda neuroner återvinns. Det mest praktiska aspekten är annonsenditionella immunfärgning som kan utföras på sektioner färgade månader innan användning av ovannämnda teknik. Framför allt skulle återvinning av morfologin avsevärt minska risken att fysiologiska data från cellerna kasseras på grund av en oförmåga att få en grundläggande morfologisk karakterisering av celltypen.

Protocol

1. biocytin Fyllning under Elektrofysiologi OBS: Läsarna kan hänvisa till alternativa källor för grundläggande patch-clamp inspelningstekniker och instrumentering 19-22, som inte utvecklats vidare här. Stegen som beskrivs här förutsätter att utrustning och förfaranden för patch-clamp inspelningar redan är etablerade, och beskrivningen kommer att begränsas till detaljerna i samband med biocytin-fyllning och post-hoc immunfärgning. Alla experiment som beskrivs i detta ma…

Representative Results

Efter ett framgångsrikt slutförande, sektionerna behåller biocytin fyllning och immunmärkning i steg 2 och kan avbildas med konfokal eller epifluorescensmikroskopi. Dessutom kommer de bearbetade sektioner också visa immunfärgning för antigenet märkts under den efterföljande bearbetningen i steg 3. I sektionen som illustreras i figur 2, var morfologin hos en biocytin fyllda neuron i en tjock sektion (300 | im) avslöjade användning av streptavid…

Discussion

Kritiska steg i protokollet

Påfyllning av lappat cellen med biocytin är det mest avgörande steget för att säkerställa full återhämtning av morfologin. För fullständig återhämtning av cellen, är det viktigt att välja en optimal skiva orientering för att minimera avskiljning av processer under skivning. Denna orientering kan variera beroende på kretsen och celltypen som undersöks. Därefter är det nödvändigt att ge tillräcklig tid för biocytin att diffund…

Materials

NaCl	Sigma	S7653	Immunostaining
KCL	Fluka	60129	Immunostaining
Na2HPO4	Sigma	S7907	Immunostaining
KH2PO4	Sigma	229806	Immunostaining
Triton X-100	Sigma	T8787	Immunostaining
Guinea pig anti CB1	Sigma	Af530-1	Immunostaining
Mouse anti CCK	CURE, UCLA	courtesy of G. Ohning	Immunostaining
Rabbit anti Parvalbumin	Swant	PV27	Immunostaining
Streptavidin, Alexa Fluor conjugate	Molecular Probes	S11227	Immunostaining
Normal goat serum	Sigma	G9023	Immunostaining
Vectashield	Vector Labs	H-1000	Immunostaining
Secondary Antibodies	Invitogen Molecular probes	Alexa Fluor conjugated dyes	Immunostaining
Labnet orbit low speed shaker	Bioexpress	S-2030-LS	Immunostaining
Forceps	Dumont	11231-30	Immunostaining
Slide folders	EMS	71520	Immunostaining
Vibratome VT 1200 S	Leica	14048142066	Electrophysiology
Multiclamp 700B amplifier	Molecular devices	Multiclamp 700B	Electrophysiology
pCLAMP 10 Software	Molecular devices	pCLAMP 10	Electrophysiology
Digitizer	Molecular Devices	Digidata 1440 digitizer	Electrophysiology
Filter tips	Nalgene	171-0020	Electrophysiology
Sonicator	Fisher Scientific	15-335-100	Electrophysiology
Microloaders	Eppendorf	930001007	Electrophysiology
Biocytin	Sigma	B4261	Electrophysiology