선형 Invadosome 형성과 활동을 연구하기위한 2D와 3D 매트릭스
Summary
이 프로토콜은 젤라틴과 콜라겐 I로 구성된 2D 혼합 매트릭스를 준비하는 방법과 선형 invadosomes를 연구하기 위해 3D 콜라겐 I 플러그를 작성하는 방법을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 선형 invadosome 형성, 매트릭스 저하 활동 및 기본 세포와 암세포 라인의 침략 기능에 대한 연구를 허용합니다.
Abstract
세포 접착, 이동 및 침입은 많은 생리적 및 병리학 적 과정에 관여한다. 예를 들어, 전이가 형성되는 동안 종양 세포는 혈액이나 림프관에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘어 침입하고 주변 조직을 통해 이동해야합니다. 이것은 세포와 세포 외 기질 (ECM) 사이의 상호 작용을 필요로합니다. 세포 수준에서, 대부분의 암세포를 포함하여 많은 세포가 ECM을 분해 할 수있는 F- 굴지 기반 구조 인 침입자를 형성 할 수 있습니다. Invadosome은 matrix metalloproteinases (MMPs)를 모집하고 활성화시키는 돌출 액틴 구조입니다. ECM의 분자 구성, 밀도, 조직 및 강성은 침입자 형성 및 활성화를 조절하는 데 중요합니다. 시험 관내 에서, 젤라틴 분석은 침입자 분해 작용을 관찰하고 정량화하는데 사용되는 표준 분석법이다. 그러나, 변성 콜라겐 I 인 젤라틴은 생리적 매트릭스가 아니며준비. I 형 콜라겐 원 섬유를 사용하는 새로운 분석법이 개발되어이 생리 학적 매트릭스가 침입자의 강력한 유도제임을 입증합니다. 콜라겐 원 섬유를 따라 형성되는 침입자는 섬유상에서 선형 구조로 인해 선형 침입자로 알려져 있습니다. 또한, 선형 invadosomes의 분자 분석은 discoidin 도메인 수용체 1 (DDR1)은 그들의 형성에 관여 수용체임을 보여 주었다. 이러한 데이터는 세포와 ECM 간의 복잡한 상호 작용을 이해하기 위해 생리 학적으로 관련이있는 매트릭스를 사용하는 것이 중요하다는 것을 분명히 보여줍니다.
Introduction
세포 외 기질 (ECM) 재 형성은 혈관 신생 및 종양 세포 침범과 같은 생리적 및 병리학 적 과정 중에 발생한다. 생리 조건에서 대부분 조혈 계통의 많은 세포 유형이 ECM 요소를 분해 할 수 있습니다. 예를 들어, 대 식세포는 조직에 도달하기 위해 해부학적인 장벽을 넘을 수 있으며 파골 세포는 칼슘 항상성을 보장하기 위해 골질을 분해합니다. 전 세계적으로 신체의 모든 매트릭스가 물리적, 화학적 특성을 유지하기 위해 갱신됩니다. 암 조직에서 종양의 미세 환경 구성이 변경됩니다. 예를 들어, 유방암과 폐암에서 I 형 콜라겐은 과발현되어 종양 주위에 축적됩니다. 더욱이,이 축적은 전이를 일으킬 위험도가 높아진다. 암 전이는 암 세포가 ECM을 저하시키고 인접 조직을 침범하는 능력에 달려 있습니다.
그만큼세포의 침입 성 활동은 침입자 (invadosome)로 알려진 특이한 액틴 풍부 구조에 기인한다. 이 용어는 정상 세포와 암 세포 ( 예 : 대 식세포, 내피 세포, MDA-MB-231 유방암 세포주와 같은 암세포)에 각각 존재하는 포도 솜 (podosomes)과 인다도 포디 아 (invadopodia)를 포함합니다. 시험 관내 에서, invadosome은 점, 집계, 또는 장미와 같은 다양한 형태로 구성 될 수 있습니다 3 . 고전적으로, invadosomes은 integrins과 vinculin 4 와 같은 접착 플라크 분자로 둘러싸인 scaffold protein Tks5와 cortactin과 같은 여러 단백질을 함유 한 F-actin 코어로 구성됩니다. 최근 Tks5와 RhoGTPase Cdc42가 기능성 침입자의 최소 분자 표지로 사용될 수 있음이 밝혀졌습니다 5 . 이러한 구조는 MT1-MMP 및 MMP-2와 같은 특정 메탈로 프로테아제 단백질의 동원 및 활성화를 통해 ECM을 분해 할 수있다. 이전 연구에서 I 형 콜라겐 원 섬유와 I 형 콜라겐 원 섬유의 특이 적 수용체 인 디스코 딘 도메인 수용체 1 (DDR1) 사이의 상호 작용이 선형 침입자라는 새로운 종류의 침입자를 형성한다고보고했습니다. Linear invadosome은 I 형 콜라겐 원 섬유에 따라 형성된다. 이러한 구조는 MT1-MMP / MMP2의 동원 및 활성화를 통해 I 형 콜라겐 섬유질을 분해 할 수 있습니다. 또한, 그들의 형성은 Tks5와 Cdc42 5 에 달려있다. 시험관 내 에서, 우리는 선형 invadosomes의 존재와 DDR1의 형성과 활동 8 의 참여를 보여 주었다 : i) 형광 젤라틴 코팅 coverslips, ii) 형광 타입 I 콜라겐 피 브릴 코팅 된 coverslips, 그리고 iii) 3D 타입 I 콜라겐 플러그. 다른 행렬의 사용으로 인해 우리는 공부할 수 있었고 성격도 좋았습니다.선형 invadosome 형성과 그들의 분해 활성을 감소시킨다. 7 , 8 .
마지막으로 침입 세포의 생물학적 특성을보다 잘 이해하기 위해 종양 미세 환경 조성의 복잡성을 모방 한 2D 및 3D 배양 시스템에서 ECM 구성 요소의 조합을 사용했습니다. 아래는 2D 및 3D 배양 시스템에서 젤라틴 / I 형 콜라겐으로 커버 슬립을 코팅하기위한 프로토콜입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
고전적으로, invadosomes는 microenvironment 및 세포가 도금되는 매트릭스에 관계없이 체외에서 공부 하고 있습니다. 젤라틴, fibronectin, vitronectin 또는 고밀도 원 섬유 콜라겐 (HDFC) 7,11을 포함하여 여러 유형의 매트릭스가 현재 사용됩니다. 그러나, 이들은 종종 세포가 존재하고 생리 학적으로 관련이없는 미세 환경을 대표하지 못한다. 여기에는 젤라틴과 섬유소 I 형 콜라겐 사이의 결합으로…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM은 INSERM / Région Aquitaine의 PhD 펠로우쉽에 의해 후원되었으며 Mount Sinai School of Medicine의 박사후 ARC 펠로우쉽과 Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. EH는 Ministère de l' Enseignement Supérieur et de la Recherche의 박사 과정에서 지원됩니다. ZE는 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 박사후 연구원이 후원합니다. CM은 Mount Sinai School of Medicine의 Tisch Cancer Institute에서 지원하고 JJBC는 NIH / NCI 보조금 K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR Fund 및 Mount Sinai School of Tisch Cancer Institute의 지원을받습니다. 이 작업은 ANR-13-JJC-JSV1-0005의 보조금으로 지원되었습니다. FS는 "Ligue nationale contre le cancer"에 의해 지원됩니다. VM 및 FS는 "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016"및 National de Cancer Institut, INCA_8036 및 PLBio2012에서 자금을 지원받습니다.
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
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