2D和3D矩阵研究线性侵袭体形成和活性
Summary
该协议描述了如何制备由明胶和胶原蛋白I组成的2D混合基质，以及3D胶原I插塞来研究线性侵袭体。这些方案允许研究线性侵袭体形成，基质降解活性和原代细胞和癌细胞系的侵袭能力。
Abstract
细胞粘附，迁移和侵袭参与许多生理和病理过程。例如，在转移形成期间，肿瘤细胞必须跨越解剖障碍以侵入和迁移穿过周围组织以便达到血液或淋巴管。这需要细胞和细胞外基质（ECM）之间的相互作用。在细胞水平上，包括大多数癌细胞在内的许多细胞能够形成invadosomes，这是能够降解ECM的基于F-肌动蛋白的结构。侵袭体是募集和激活基质金属蛋白酶（MMP）的突出肌动蛋白结构。 ECM的分子组成，密度，组织和刚度在调节invadosome形成和激活中是至关重要的。 在体外 ，明胶测定是用于观察和定量侵袭体降解活性的标准测定法。然而，变性胶原I的明胶不是生理基质e字元素。开发了使用I型胶原原纤维的新型测定法，并用于证明该生理基质是侵入体的有效诱导剂。由于它们在纤维上的线性组织，沿着胶原纤维形成的侵袭体被称为线性侵袭体。此外，线性invadosomes的分子分析表明，盘状结构域受体1（DDR1）是参与其形成的受体。这些数据清楚地表明了使用生理相关基质以了解细胞与ECM之间的复杂相互作用的重要性。
Introduction
细胞外基质（ECM）重塑发生在生理和病理过程中，如血管生成和肿瘤细胞侵袭。在生理条件下，许多细胞类型，主要来自造血系，能够降解ECM元件。例如，巨噬细胞能够跨越解剖障碍以达到组织，并且破骨细胞降解骨基质以确保钙稳态。在全球范围内，身体中的所有基质更新以维持其物理和化学性质。在癌组织中，肿瘤微环境组成被改变。例如，在乳腺癌和肺癌中，I型胶原蛋白被过度表达并在肿瘤周围积聚。此外，这种积累与发生转移的风险增加相关1,2 。癌转移依赖于癌细胞降解ECM并侵入邻近组织的能力。
该细胞的侵袭活性归因于被称为invadosome的专门的肌动蛋白丰富的结构。该术语包括分别存在于正常和癌细胞（ 例如，巨噬细胞，内皮细胞和癌细胞如MDA-MB-231乳腺癌细胞系）中的囊体和隐球菌。 体外 ，invadosomes可以组织成不同的形状：点，聚集体或花环3 。经典地，侵袭体由含有若干蛋白质的F-肌动蛋白核心组成，如骨架蛋白Tks5和皮质激素，被粘附斑块分子包围，如整联蛋白和连锁蛋白4 。最近，显示Tks5和RhoGTPase Cdc42可以用作功能性侵袭体5的最小分子标记。这些结构能够通过募集和激活特异性金属蛋白酶蛋白（如MT1-MMP和MMP-2 6）来降解ECM。在之前的研究中，我们报道了I型胶原原纤维与I型胶原原纤维的特异性受体的盘状蛋白结构域受体1（DDR1）之间的相互作用导致形成一类称为线性侵袭体的新型invadosome。沿着I型胶原纤维7形成线性侵袭体。这些结构能够通过募集和激活MT1-MMP / MMP2来降解I型胶原原纤维。此外，它们的形成取决于Tks5和Cdc42 5 。 在体外 ，我们证明线性侵袭体的存在和DDR1参与其形成和活动8使用由各种基质元素的组合组成的不同策略，包括：i）荧光明胶包被的盖玻片，ii）荧光I型胶原原纤维涂层盖玻片，和iii）3D I型胶原蛋白塞。由于使用不同的矩阵，我们能够学习和品格ize线性侵袭体形成及其降解活性7,8 。
最后，为了更好地了解入侵细胞的生物学，使用2D和3D培养系统中的ECM组分的组合，模拟肿瘤微环境组成的复杂性。以下是在2D和3D培养系统中用明胶/ I型胶原涂覆盖玻片的方案。
Protocol
Representative Results
Discussion
经典地， 在体外研究侵袭体，而不考虑微环境和细胞被电镀的基质。目前使用几种类型的基质，包括明胶，纤连蛋白，玻连蛋白或高密度纤维胶原（HDFC） 7,11 ;然而，这些通常不代表细胞存在并且不具有生理学相关性的微环境。在这里，使用由明胶和纤维I型胶原之间的关联组成的新型基质。使用I型胶原原纤维可以使我们突出出一种新颖的侵袭体，被称为线形侵袭?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
JDM得到了INSERM /RégionAquitaine博士研究生的支持，现在得到博士后ARC研究金和西奈山医学院Tisch癌症研究所的支持。 EH得到了Ministèrede l'EnseignementSupérieuret de la Recherche博士的支持。 ZE得到了国立国民大学（ANR）的博士后研究金的支持。 CM由西奈山医学院Tisch癌症研究所支持，JJBC得到NIH / NCI授权K22CA196750，TCI青年科学家癌症研究奖JJR基金和西奈山医学院Tisch癌症研究所的支持。这项工作得到ANR-13-JJC-JSV1-0005的资助。 FS由“Ligue nationale contre le cancer”支持。 VM和FS由“EquipeLabelliséeLigue Nationale contre le Cancer 2016”和Institut National du Cancer，INCA_8036和PLBio2012的资助提供支持。
Materials
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1X PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1X + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10X PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
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