Summary
توسع الأوعية التي يسببها الأنسولين ينظم نضح العضلات ويزيد في ميكروفاسكولار سطح المنطقة (microvascular التوظيف) متاح لتبادل ذائبة بين إينتيرستيتيوم الدم والأنسجة. يقدم الفحص المجهري إينترافيتال المشتركة وتعزيز التباين الموجات فوق الصوتية لتقييم العمل للأنسولين في السفن الكبيرة ودوران الأوعية الدقيقة في نفس الوقت في المجراة.
Abstract
وقد ثبت أن تسهم الإجراءات الأوعية الدموية للأنسولين في تنظيم حساسية الأنسولين. تنظيم الآثار للأنسولين في العضلات نضح قد إيصال المواد الغذائية والهرمونات إلى أنسجة حساسة للأنسولين. ونحن هنا وصف أسلوب الجمع بين إينترافيتال المجهري (ناقلات) والتباين--تعزيز تخطيط الصدى (سويس) حجرة المقربة من اللكتات الماوس في نفس الوقت تصور الشرايين مقاومة العضلات والتروية دوران الأوعية الدقيقة المجراة في. في نفس الوقت تقييم الأثر للأنسولين على مستويات متعددة من شجرة الأوعية الدموية مهم لدراسة العلاقات بين الآثار فعال في الأوعية المتعددة بالانسولين ونضح العضلات. وأجريت تجارب في هذه الدراسة في الفئران. أولاً، يتم إدراج قنية الوريد الذيل لضخ التخدير ومركبات فعال في الأوعية وعامل تباين الموجات فوق الصوتية (ميكروبوبليس تغليف المادة الدهنية). ثانيا، اعتماد على شق صغير في منطقة الفخذ لفضح الشجرة الشريانية المقصورة العضلات المقربة. ثم وضع مسبار الموجات فوق الصوتية عند اللكتات العلوي كونترالاتيرال لعرض العضلات في المقطع العرضي. تقييم البارامترات الأساسية، يتم تقييم قطر الشرايين وبعد ذلك هي التي غرست ميكروبوبليس في معدل ثابت لتقدير تدفق الدم في العضلات وحجم الدم ميكروفاسكولار (MBV). عندما تطبق قبل وأثناء المشبك hyperinsulinemic-يوجليسيميك، تسمح مجتمعة ناقلات الأمراض وسويس تقييم التغيرات المستحثة بالانسولين قطر الشرايين والعضلات microvascular نضح وحساسية الأنسولين الجسم بكامله. وعلاوة على ذلك، يمكن قياسها كمياً العلاقة الزمنية بين الاستجابات لدوران الأوعية الدقيقة والشرايين المقاومة للأنسولين. من الممكن أيضا لمتابعة الوقت طوليا في الفئران، يجعلها أداة قيمة لدراسة التغيرات في حساسية الأنسولين والأوعية الدموية والجسم كله.
Introduction
واستجابة لارتفاع في مستوى الجلوكوز في الدم، تفرز البنكرياس الأنسولين في مجرى الدم حيث يتم توزيعه بسرعة في الأنسجة المستهدفة مثل الهيكل العظمى والعضلات، عن طريق مقاومة الشرايين والشعيرات الدموية. الهيكل العظمى والعضلات مسؤولة عن ~ 80% من امتصاص الجلوكوز قد1. إيصال الأنسولين إلى إينتيرستيتيوم الهيكل العظمى والعضلات قد ثبت أن معدل الحد خطوة للإجراءات الأيضية للأنسولين التي تعزز الجلوكوز التخلص من2،،من34. خلال 10-15 دقيقة، والإنسولين يزيد حجم الدم الشعرية (microvascular التوظيف)، هو تأثير الذي يحدث قبل أن يزيد تدفق الدم المجموع5،6. التوظيف microvascular يوسع غشائي المساحة المتاحة لتبادل المواد الغذائية (والإنسولين)7،8. تسبق التوظيف microvascular بوساطة الأنسولين ويرتبط بشكل مستقل مع التغييرات في الهيكل العظمى والعضلات الجلوكوز امتصاص8،9. تأثير الأنسولين على المفرج سمي 'حساسية الأنسولين والأوعية الدموية'.
فقد ثبت أن الأنسولين بوساطة التوظيف ميكروفاسكولار وتوسع الأوعية التي يسببها الأنسولين هي ضعف في السمنة زوكر الفئران10،11. وعلاوة على ذلك، عرض الفئران العجاف مع انخفاض الكثافة الشعرية العضلات الأنسولين المقاومة12. في أعمالها ذات النفوذ، أظهرت كوبوتا et al. أن ضعف الأنسولين الإشارات في خلايا بطانية تسبب في الحد من التوظيف microvascular المستحثة بالانسولين، مما يخفض امتصاص الجلوكوز في الهيكل العظمى والعضلات بحوالي 40%13. هذه التشوهات في دالة ميكروفاسكولار لا فقط تحدث في العضلات، ولكن أيضا في عدة أخرى من الأنسجة والأعضاء مثل القلب، والشبكية والكلى14،،من1516. هذه الأمثلة وغيرها الدراسات17،،من1819،20 تشير إلى أن آثار الأوعية الدموية للأنسولين إليه هامة في الفسيولوجيا (مرضية) لمقاومة الأنسولين، وبه المضاعفات.
أن هناك أدلة جوهرية أن الأنسولين يزيد من حجم الدم ميكروفاسكولار (MBV) في الهيكل العظمى والعضلات5،6، فإن الآليات التي يحدث هذا ليست مفهومة تماما9. البطانة-تعتمد على توسع الأوعية ضروري في جوانب كثيرة من الأنسولين الأوعية الدموية حساسية21،،من2223 على مختلف المستويات للمفرج. حساسية الأنسولين والأوعية الدموية يمكن أن يعبر عن نفسه باسترخاء الشرايين المقاومة المستحثة بالانسولين واسترخاء الشرايين الشعرية مسبقاً لزيادة تبادل microvascular perfused مساحة7،24، 25.
وقد استخدمت إينترافيتال المجهري (الناقلات) في مجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية الأنسجة بما في ذلك الدوائر skinfold dorsum الماوس26، مساريق من الماوس وفار27، ونماذج من الاسكيمية أطرافهم في الماوس28 والحقيبة الخد الهامستر 29-تعزيز التباين الموجات فوق الصوتية (سويس) هو تقنية التصوير أخرى تسمح بتقييم لدوران الأوعية الدقيقة في القلب30 فضلا عن الهيكل العظمى والعضلات31. فإنه يستخدم ميكروبوبليس مملوءة بغاز خامل التي تتصرف رهيولوجيكالي كخلايا الدم الحمراء وتبقى كلياً داخل التجويف الأوعية الدموية. هذه ميكروبوبليس هي التي غرست عن طريق الوريد بمعدل ثابت لتحقيق حالة مستقرة. موجه الموجات فوق الصوتية عالية طاقة، ثم، يمكن استخدامها لتدمير ميكروبوبليس. يمثل ميكروبوبليس لسرعة التجديد في المنطقة لمصلحة (ROI) سرعة تدفق (مفف). يمثل كثافة إشارة مجموع الصورة التباين في MBV. يمكن أن يؤديها سويس (كما في البشر) مرارا وتكرارا، وأنها متقدمة فهم خلل الأوعية الدموية التي تحدث في الدول المقاومة للأنسولين (نوقشت في باريت et al. 32).
في الدراسة الحالية يصف لنا تقنية جديدة لدراسة تنظيم التروية العضلات، عن طريق الاستخدام المتزامن لناقلات الأمراض وسويس. نركز هنا على الإجراءات الأنسولين في الأوعية الدموية في حجرة المقربة من اللكتات الماوس. هذه المقصورة واحدة من أكبر مجموعات الهيكل العظمى والعضلات في الماوس، تمكين الدراسات امتصاص الجلوكوز المحلية في العضلات تمثيلية. هذه المقصورة مثالي لناقلات الأمراض إعداد وتصور الشرايين هي سهولة الوصول إليها من قبل إجراء العمليات جراحية موحد28. وعلاوة على ذلك، أظهرت المجموعة الخاصة بنا وآخرين أن سويس يمكن أن تستخدم في هذه المقصورة33،34.
ميزة تقنية ناقلات الأمراض وسويس مجتمعة هو إمكانية تقييم الأثر للأنسولين على مستوى الشرايين الكبيرة (الشرايين تغذية أو المقاومة) ودوران الأوعية الدقيقة (الشعرية سريراً) في نفس مجموعة العضلات. وبالإضافة إلى ذلك، التطبيق المتزامن لهاتين الطريقتين ثاقبة العمل الزمنية للأنسولين في مستويات مقاومة الشرايين ودوران الأوعية الدقيقة. هذا إلى جانب ناقلات الأمراض، ويمكن أيضا تنفيذ تقنية سويس في ميادين البيولوجيا والأوعية الدموية الأخرى. على سبيل المثال، يمكن دراسة دور البروتينات المختلفة وبعض الشروط الفيزيولوجية المرضية التي تؤثر على البطانة باستخدام نماذج خروج المغلوب. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام كلا التقنيات في الماوس واحد في نقاط زمنية متعددة تقليل وقت وتكلفة البحوث.
Protocol
جميع التجارب على الحيوانات أقرتها الرعاية الحيوانية المحلية واللجنة الأخلاقية. بروتوكول كامل من تحريض التخدير في الماوس حتى نهاية المشبك hyperinsulinemic-يوجليسيميك يأخذ حوالي 2 ح.
1-إعداد ميكروسورجيكال
- حمل التخدير جنبا إلى جنب مع التسكين في ماوس ذكور تزن 20-25 ز بعد ح 14 أو بين ليلة وضحاها الصيام مع حقن داخل شيفتشنكو (0.31 مغ/كغ) والميدازولام (6.25 ملغ/كغ) و Acepromazine (6.25 ملغ/كغ) (التخدير الدلع) ووضعه على لوحة تدفئة هوميوثيرميك يسيطر عليها درجة حرارة المستقيم الذي يحافظ على درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية.
- تطهير الجدول العملية والمعدات لعدة مرات استخدام حل يستند إلى الكحول.
- إرفاق إبرة ز 27 10 سم أنبوب طويل البولي إثيلين (PE-20) وإرفاق الأنبوب موصل 4-الطريق. أدخل الإبرة في الوريد الذيل ويحملق باستخدام هلام التصاق الأنسجة. سيتم استخدام هذه القنية لضخ ميكروبوبليس والإنسولين، والسكر والتخدير.
ملاحظة: إضافة الهيبارين (5 U/mL) في المحلول الملحي معقمة أثناء كانوليشن عملية مسح على المنوال الذيل (حوالي 10 ميليلتر) يقلل من إمكانية انسداد cannulas. - طوال الإجراءات الجراحية والبروتوكولات التجريبية، المحافظة على التخدير قبل تسريب الوريدي مستمر للتخدير الدلع عبر قنية الوريد ذيل 33.75 ميليلتر/كغ/دقيقة بمعدل.
- ضع الماوس مع الجانب البطني أعلى وإصلاح القدمين باستخدام شريط الحرارة للكشف عن منطقة الفخذ العلوية. استخدام اكسوروتيشن طفيف الورك (مواجهة الكفوف اللكتات) وزاوية 40-60 درجة مئوية في الركبة لتوحيد تمتد للعضلات في حجرة المقربة للفخذ.
- إزالة الشعر في الفخذ والفخذ العلوي المناطق على الصعيد الثنائي باستخدام كريم مزيل الشعر. جمع كل الشعر فضفاضة مع مسحه القطن رطبة.
- ضع الماوس تحت ستيريوميكروسكوبي والخطوات الجراحية التالية باستخدام 10 X إلى 16 X التكبير.
- جعل شق 2 سم باستخدام مقص الجلد مواز للرباط الآربي، الأفقي فقط إلى انحناء البطن (الشكل 1). تطبيق الجر في الجهة البعيدة من شق ديستالي استخدام لدغ المشبك (الشكل 1). وهذا سيساعد على ضبط الإطار حسب الحاجة والمساعدة في عقد زيت البارافين (الموصوفة في 1.12).
- تشريح الأنسجة الدهنية الواقعة خارج جدار البطن. لتجنب النزيف، بلطف فصل لوحة الدهون من الجدار بدلاً من تشريح مباشرة من خلال لوحة المفاتيح. الجر لطيف في لوحة الدهون في اتجاه القاصي ستسهل العملية (الشكل 1).
- تحديد شريان فخذي واتبع ذلك وصولاً إلى الفروع الرئيسية الأولى (شرسوفي الشريان والشريان مرهف) (الشكل 2). هو أول فرع رئيسي من شريان فخذي يعمل على العضلات المقربة ماغنوس الشريان مرهف وثم يقوم بتشغيل العميق للعضلات مرهف. سيتم استخدام الشريان مرهف لناقلات الأمراض.
- تحديد اللفافة العميقة شفافة تغطي العضلات والأوعية. استخدام الملقط حادة، سحب اللفافة صعودا وقطع عليه باستخدام ميكروسسيسور.
- تغطي العضلات المكشوفة مع انخفاض (200 ميليلتر) من البارافين السائل الطبية (غرفة درجة الحرارة، أو قبل تسخينها إلى 37 درجة مئوية) لمنع أنسجة المعدة من الجفاف. تأكد من أن لا تسرب قطره النفط بعيداً. ضبط طيات الجلد شق استخدام المشبك لدغ لإنشاء تجويف صغير عقد زيت البارافين بالاستحمام السفن.
- ضع الماوس تحت مجهر معايرة سابقا (16 X التكبير البصري) في مثل هذه طريقة أن الشريان مرهف بشكل عمودي على شاشة الكمبيوتر. إرفاق المجهر للكاميرا والكمبيوتر على أساس نظام التحليل التي يمكن استخراجها قطر السفن من مجموعة بيانات الصورة. القطر هو المسافة بين الجانبين لومينال السفينة. الرصد المستمر وقياس قطر الشريان مرغوب فيه.
- وضع مصدر الضوء على مسافة كافية (الحد الأدنى 20 سم) من اللكتات لتقليل التوصيل الرأس من الضوء.
- تطبيق هلام توصيل الموجات فوق الصوتية بريوارميد اللكتات contralateral العلوي. وضع مسبار الموجات فوق الصوتية عمودي على المحور الطويل في عظم الفخذ.
- بعناية قم بضبط زاوية واتجاه المسبار بالموجات فوق الصوتية للحصول على طريقة عرض المقطع العرضي لمجموعة العضلات المقربة. الحرص على الحفاظ على موقف مسبار الموجات فوق الصوتية بالنسبة للماوس مستقرة للحفاظ على نفس الطائرة التصوير لقياس خط الأساس و hyperinsulinemic.
- واسمحوا الماوس استقرار لمدة 30 دقيقة. ينبغي أن يكون قطر الشريان مرهف مستقرة لمدة 10 دقائق قبل توثيق قطر خط الأساس.
2-خط الأساس وقياسات Hyperinsulinemic
- تأكد من أن يتم حفظ قطر الشريان مرهف خط الأساس بالبرنامج الحاسوبي المستخدم لناقلات الأمراض.
- إعداد ميكروبوبليس مقدما ك وصف35 والعد مع كولتر مضادة لتركيز 2.5 × 109 فقاعات مليلتر قبل التجربة.
-
كما يمكن عرضها ميكروبوبليس فقط في وضع التباين من جهاز الموجات فوق الصوتية، التحكم المعلمات التي تؤثر على الصورة تناقض البيانات التي يتم جمعها (المبين في 2.3.1) واستخدام دائماً من خلال اقتناء.
- استخدم الإعدادات التالية على جهاز الموجات فوق الصوتية: كسب التباين في 35 ديسيبل؛ الوقت الحصول على تعويض لإيقاف التشغيل؛ خط الكثافة العالية؛ عدد من مناطق التنسيق على نطاق واسع؛ نقل الطاقة بنسبة 4 في المائة؛ إرسال عرض الحزمة إلى مستوى؛ بوابة SV إلى 4؛ حساسية إلى 1؛ استمرار إيقاف تشغيل. مستوى موقع المناطق المحورية إلى مركز منطقة الفائدة.
- حفظ قصيرة (5 ق) قصاصة. سيتم استخدام هذا لحساب الإشارات الخلفية.
- تهز القنينة التي تحتوي على ميكروبوبليس من جهة أن يكون تعليق موحدة. بدء غرس ميكروبوبليس استخدام قنية الوريد ذيل بمعدل 5 ميليلتر في دقيقة. ضع أنبوب ضخ في دوامة الاهتزاز (200 x في الدقيقة) الإبقاء على تعليق موحد ميكروبوبليس.
- السماح 5 دقيقة للتسريب المستمر من ميكروبوبليس بحيث يتم التوصل إلى مستوى الحالة المستقرة. المضي قدما في الحصول على منحنيات الزمن-كثافة الفقاعات باستخدام الدالة ميكروبوبلي التدمير (مليون برميل يوميا) على جهاز الموجات فوق الصوتية في 5 دقائق وفي 10 دقيقة بعد بدء ضخ ميكروبوبليس (الشكل 3A). أن إشارة متوسط هذه القياسات اثنين للحصول على بيانات خط الأساس التروية.
-
بعد الحصول على بيانات خط الأساس، بدء المشبك hyperinsulinemic-يوجليسيميك ك وصف34. استخدام قنية الذيل (توضع في 1.3) لإدارة الأنسولين والجلوكوز (والتخدير).
- وباختصار، حمل دولة hyperinsulinemic بإدخال بلعه الأنسولين 200 مو/كغ متبوعاً بضخ الأنسولين المستمر (7.5 مو/كغم/دقيقة) عن 60 دقيقة استخدام جرعة متغير % 20 د-الجلوكوز للحفاظ على يوجليسيميا.
- تقدير الجلوكوز في الدم من الوريد ذيل كل 5 دقائق مع "جهاز مراقبة الجلوكوز"، والحفاظ على الأقل 5 ملم بضبط معدل ضخ الجلوكوز متغير. تحديد حساسية الأنسولين بحساب متوسط معدل ضخ الجلوكوز يعني خلال 30 دقيقة الأخيرة.
- تأكد من أن يتم توثيق قطر الشريان مرهف في الفترات الزمنية المطلوبة (على سبيل المثال في الساعة 10، 30 و 60 دقيقة) لبدء المشبك hyperinsulinemic-يوجليسيميك مع البرنامج الحاسوبي.
- بعد 25 دقيقة و/أو 55 دقيقة من المشبك الأنسولين، تبدأ بقياس (hyperinsulinemic) سويس الثانية لتوثيق MBV في 30 أو 60 دقيقة، على التوالي. اتبع نفس الخطوات الموضحة في 2.4 و 2.5. فصل واستخدام ميناء الموصل 4-طريقة التخدير لبث في ميكروبوبليس. أعد أنبوب التخدير بعد انتهاء ضخ ميكروبوبليس.
- بعد الانتهاء من ناقلات الأمراض وقياسات سويس 60 دقيقة بعد البدء ضخ الأنسولين، سحب الدم من الماوس بإجراء ثقب قلب لتحليلها في وقت لاحق. وهذا سوف euthanize أيضا الماوس. تشريح مرهف وشرايين الفخذ وتخزينها لمزيد من التجارب المطلوب بعناية ( مثلالبقع الغربية، إيمونوهيستوتشيميستري، السابقين فيفو الضغط ميوجرافي تجارب3736،، 38).
3-اتصال التحليل
ملاحظة: تحليل القياسات ناقلات الأمراض وسويس ينبغي أن يؤديها دون اتصال محقق أعمى. سويس يوفر إمكانية التمييز بين دوران الأوعية الدقيقة من سفن أكبر حجماً بالتدمير مؤقتاً ميكروبوبليس بارتفاع كثافة الموجات فوق الصوتية موجات باستخدام الدالة مليون برميل يوميا. يتم استعادة الإشارة (مقاسا بوحدات التعسفي (a.u)) في السفن الأكبر حجماً أسرع من تلك التي في دوران الأوعية الدقيقة بسبب سرعة ميكروبوبليس في الأوعية المقابلة.
- استخدام محطة العمل دون اتصال أو البرنامج على جهاز الموجات فوق الصوتية للقيام بالتحليلات.
- رسم منطقة المصالح (ROI) تشمل دوران الأوعية الدقيقة. رسم عائد منفصلة ليشمل السفن الأكبر حجماً فخذي (الشكل 3A).
- تكرار رويس في دوران الأوعية الدقيقة وأكبر السفن للخلفية وخط الأساس و hyperinsulinemic القياسات باستخدام دالة نسخ دوروا بنيت في البرنامج.
- طرح إشارة كثافة من قياس الخلفية من خط الأساس والقياسات hyperinsulinemic.
- تقسيم الإشارة كثافة من دوران الأوعية الدقيقة بإشارة كثافة الأوعية فخذي. ويمكن الآن مقارنة مبفس الأساس و hyperinsulinemic.
Representative Results
وكان معدل ضخ الجلوكوز خلال المشبك hyperinsulinemic-يوجليسيميك (حساسية الأنسولين) 180.21 ± 19.81 µmol/كغ/دقيقة التطبيق المحلي لزيت البارافين في حجرة العضلات المقربة استقرار السفينة لم تغير خط متوسط القطر الشرايين (73.6 ± 29.0 ميكرومتر مقابل 68.8 ± 17.9 ميكرومتر؛ p = 0.58) ولكن ساعدت على تقليل التباين اختبار الحيوانات (الشكل 4 أ). الأنسولين زادت قطر الشريان مرهف باستمرار (بواسطة ± 14.58 6.2% في 60 دقيقة؛ N = 9) التي كانت تختلف اختلافاً كبيرا (ف < 0.0001) من تغيير القطر الناجم عن ضخ المالحة (-6.3 ± 4.9 في المائة؛ N = 6). توسع الأوعية التي يسببها الأنسولين كان ملموسا بعد 10 دقيقة (10.09 ± 5، 1%؛ p = 0.002) ووصلت إلى ما يقرب من 95 في المائة سعتها القصوى بالمماطلة بعد 30 دقيقة.
استخدام سويس، الأنسولين استمرار زيادة العضلات MBV (الشكل 5A) بنسبة 33.5 في المائة (± 31.04% N = 7؛ p = 0.0009) عند مقارنتها بضخ المالحة (-10.63 ± 27.87% N = 6) (الشكل 5 (ب)). البيانات المعروضة هي كثافة إشارة عضلة MBV مقسوماً على التي في الأوعية فخذي. وهذا يقلل التجريبية الاختلاف بين القياسات المختلفة وبين الفئران المختلفة (البيانات لا تظهر). كثافة إشارة في الأوعية فخذي يقابل خطيا مع تركيز ميكروبوبليس في الدورة الدموية (الشكل 3). تصحيح لإشارة السفن فخذي نظرياً بتصحيح الاختلافات في تركيزات ميكروبوبليس المستخدمة (3D الشكل). يتم عرض البيانات في هذا القسم كما يعني ± الانحراف المعياري.
رقم 1: المعرض الجراحية المقصورة المقربة من اللكتات. (أ) شق مصنوع في الفخذ، موازية لاتجاه الرباط الآربي. (ب) الجر لطيف في لوحة الدهون في الاتجاهات البعيدة (الأسهم السوداء) سيقدم النسيج الضام (*) بين لوحة الدهون وجدار البطن. يمكن ضبط (ج) الجلد طيات الشق استخدام المشبك لدغ لإنشاء تجويف صغير عقد زيت البارافين بالاستحمام السفن. يتم وضع مسبار (د) الموجات فوق الصوتية على اللكتات العلوي contralateral بعد الشريان مرهف استعداد يتم عرضها باستخدام مجهر معايرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: المجهري إينترافيتال من اللكتات الماوس. شريان فخذي (A) يؤدي إلى شريان شرسوفي (ب) والشريان مرهف (ج) التي تدير أكثر من مجموعة العضلات المقربة (د). يتم استخدام الشريان مرهف لناقلات الأمراض استخدام مجهر معايرة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إشارة كثافة الموجات فوق الصوتية المزودة بالتباين في حجم الدم ميكروفاسكولار العضلات والأوعية فخذي. (أ) عرض من التباين غير الخطية التصوير وضع منهاج التصوير الرقمي خلال التسريب المستمر ميكروبوبليس في اللكتات العلوي ماوس ذكور. اللوحة اليسرى: يتم رسمها رويس اثنين لتمثيل العضلات MBV وسفن فخذي. فقط الجزء السطحي من حجرة العضلات المقربة تم تضمينه في العائد على الاستثمار كالإشارة يقلل كثافة مع العمق. اللوحة اليسرى: منحنى كثافة الوقت من العضلات MBV دوروا. وتمثل الخطوط العمودية تدمير ميكروبوبليس (مليون برميل يوميا) مع موجات عالية الطاقة. فورا بعد مليون برميل يوميا، لا عامل تباين موجود في الطائرة التصوير الذي يبدأ بملء مع ميكروبوبليس تدريجيا. بعد 10-15 ثانية، تم بلوغ الذروة لتعزيز التباين. (ب-د) بعد التوصل إلى إشارة حالة ثابتة، قد تضاعف معدل ضخ 2.5 × 109 فقاعات مليلتر (5، 10، 20 ميليلتر/دقيقة). كثافة إشارة من العضلات MBV (ب) وتوازيها فخذي السفن (ج) مضاعفة تركيز ميكروبوبلي في الدورة الدموية. (د) تصحيح العضلات MBV لإشارة السفن فخذي يزيل التغير في كثافة إشارة الناجمة عن تركيزات مختلفة ميكروبوبلي (N = 9؛ أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
4 الرقم: المجهري إينترافيتال قياسات الشريان مرهف. (أ) زيت البارافين يقلل من تفاوت الشرايين مرهف من الحيوانات المختلفة (وهو مكم 29.0 دون البارافين مقابل 17.9 ميكرون بعد تطبيق النفط) مع الحفاظ على خط متوسط القطر مستقرة (73.6 ميكرومتر مقابل 68.8 ميكرومتر؛ p = 0.58). (ب) أقطار الشرياني عند خط الأساس، وبعد 60 دقيقة من الحقن الأنسولين أو المالحة. الأنسولين بعد ضخ 60 دقيقة المتوسعة دائماً الشريان مرهف (ف < 0.0001) عند مقارنتها بضخ المالحة. (ج) التي يسببها الأنسولين توسع الأوعية يحدث في 10 دقيقة بعد بدء ضخ (p = 0.002) وتصل إلى 95 في المائة من الحد الأقصى في 30 دقيقة أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري؛ يتم استخدام الاختبار T مزاوج الطالب للإحصاءات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
5 الرقم: Microvascular قياسات حجم الدم باستخدام الموجات فوق الصوتية محسنة على النقيض من "حجرة العضلات المقربة" من "اللكتات الماوس". الأنسولين (A) أدى إلى زيادة متسقة في MBV 30 دقيقة بعد بدء ضخ الأنسولين. (ب) الفرق بين hyperinsulinemic وقياسات أساسية (تغيير MBV) تتم الإشارة إليها كتوظيف microvascular بوساطة الأنسولين. الأنسولين الناجمين عن 33.5 في المائة (± 31.04%، p = 0.016؛ N = 7) تجنيد microvascular مقارنة بضخ المالحة (-10.63 ± 27.87% N = 6). أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري؛ يتم استخدام الاختبار T مزاوج الطالب للإحصاءات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
قمنا بتطوير تقنية لتقدير الإجراءات الأنسولين في الأوعية الدموية في الشرايين الكبيرة (باستخدام ناقلات الأمراض)، والهيكل العظمى والعضلات دوران الأوعية الدقيقة (باستخدام سويس) في نفس الوقت. الخطوات الحاسمة لقياس النجاح وموثوق بها: 1) بشكل صحيح يعرض الشريان مرهف دون نزيف؛ 2) منع تسرب زيت البارافين الاستحمام الشريان؛ 3) بعد وصول وريدي البراءات (ذيل الوريد القنية) لضخ مجمعات فعال في الأوعية (الأنسولين) وعامل تباين (ميكروبوبليس).
دراسة microvascular خلل في العضلات يكتسب الاهتمام في سياق السمنة والإنسولين المقاومة14،25،،من3940. ويتجلى التأثير السلبي للبدانة ومقاومة الأنسولين على وظيفة الأوعية الدموية على مستويات مختلفة من شجرة الأوعية الدموية. من الآن فصاعدا، مطلوبة نهج مختلفة لتقييم هذه التغييرات. ويوفر الجمع بين استخدام تقنيات سيوس وناقلات الأمراض في الماوس نفسه أداة قوية التحديد الكمي لآثار الأنسولين بمستويات مختلفة من المفرج. ناقلات الأمراض يسمح التصور المباشر والتحليل الكمي للشريان المقاومة ويسمح سويس لتقييم التغيرات المستحثة بالانسولين في العضلات التروية.
دراسة حجرة العضلات المقربة له العديد من المزايا. الشرايين متاحة وطبيعة الشق سطحي يجعل من الممكن لإغلاق شق الجلد بخياطة الجروح عقيمة امتصاص 5.0 بعد الانتهاء من التجربة. حقن تحت الجلد مع البوبرينورفين بعد التجارب كمسكن بجرعة 0.1 مغ/كغ الحيوانات ويسمح باسترداد في بيئة دافئة. الفئران يسمح الإجراء جيد جداً وعانينا من أي فقدان للحيوانات ولا التهابات اللكتات في الحيوانات أكثر من 35 درس. وهذا يجعل من الممكن للمتابعة، أو دراسة الحيوانات بطريقة طولية. تم تخديره الحيوانات المستخدمة في هذه التجارب، ومع ذلك، استخدام isoflurane 1.8 ٪ استنشاقه متوازنة مع الأكسجين المتدفقة في 0.4 لتر/دقيقة على الرغم من قناع تخدير. على النقيض من isoflurane التخدير41،42، عدم الإزعاج التخدير الدلع حساسية الأنسولين المحيطية. خطة مستقبلية لدراسة كيفية استرداد الفئران من التخدير الدلع.
حجرة العضلات المقربة مفيد أيضا منذ المركبات فعال في الأوعية المختلفة الوساطة المحلية ويمكن تقييم آثار الأوعية الدموية المتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، التطبيق الموضعي لهذه المركبات للنسيج المستهدف عمليا باستخدام تقنيات سوبيرفوسيون28 أو التلاعب بالعمليات الجراحية وغرس الأصفاد التينج المخدرات المحيطة السفن43. وعلاوة على ذلك، يمكن عزل الشريان مرهف ودرس في ميوجراف الضغط. مجموعتنا وغيرها قد تجمعوا أدلة تجريبية كبيرة باستخدام ميوجراف الضغط لتوثيق آثار الأنسولين وغيرها من المركبات فعال في الأوعية على هذا الشريان السابقين فيفو36،،من3738.
حد ملازمة للاستخدام تقنية ناقلات الأمراض هو المعرض الجراحية للعضلات وتطبيق زيت البارافين لاستقرار هذه السفن. لم يتضح بعد ما إذا كانت هذه الإجراءات تأثير البيئة الأصلية للشريان. بيد أن الشكل 3A تبين أن قطر الشريان مرهف حمم في زيت البارافين الأساس لا يغير إلى حد كبير. وقد ثبت أيضا أن الزيوت المعدنية بنجاح يحول دون انتشار الأكسجين، وحماية الأنسجة من هايبروكسيك ظروف44. وعلاوة على ذلك، يساعد النفط للحد من التباين في قطر خط الأساس للشرايين. وهذا السبب في أننا ندعو إلى استخدام زيت البارافين وترك بقية التحضير لمدة 30 دقيقة على الأقل. من المذكرة، أدى استخدام المحلول الملحي مخزنة بشكل مؤقت بدلاً من-أو لا زيت على الإطلاق – أقطار اختلافاً كبيرا وانقباض السفينة (البيانات لا تظهر). وعلاوة على ذلك، في نهاية هذه التجارب، نحن معزولة الشرايين مرهف-حمم في زيت البارافين-واختبارها مفاعليه في ميوجراف الضغط السابقين فيفو. كان رد فعل الشرايين حمم زيت البارافين وبالمثل للتحكم في الشرايين عندما حفزت مع الأنسولين واستيل (وعائي) (البيانات لا تظهر). توسع الأوعية التي يسببها الأنسولين متسقة يبين بوضوح أن البروتوكول ناقلات الأمراض الوارد وصفها في هذه الدراسة وتنتج نتائج يمكن الاعتماد عليها.
الاستفادة من تطبيق تقنيات كلا في الماوس نفسه يتغلب على بعض أوجه القصور الجوهرية في أسلوب واحد قبل الآخر: تقديرات سويس MBV في العضلات دون عائق الحية، ولكن لا يمكن رؤية السفن الفردية؛ ناقلات الأمراض يجعل من الممكن لمشاهدة السفن الفردية، رغم أنه لا يمكن تقدير MBV. خطة مستقبلية الاستفادة من الفحص المجهري ناقلات الأمراض للعضلات كريماستير في تركيبة مع سويس للعضلات المقربة من ناحية كونترالاتيرال. هذا التعديل يمكن أن تقدم تقديراً ل MBV (باستخدام سويس) وبصرية إمكانية وصول مباشر إلى الشعيرات الدموية (باستخدام ناقلات الأمراض). يمكن أيضا تعديل البروتوكول؛ يمكن أن تنتقل بالموصل 4-الطريقة المستخدمة قنية الذيل إلى موصل 5-طريقة. وبهذا يمكننا تجنب فصل أنبوب التخدير أثناء إجراء قياس سويس ثانية (المذكورة في النقطة 2.9). في تجربتنا، التسامح الفئران في البروتوكول الحالي أيضا. تعديل آخر التي يمكن إجراؤها لهذا البروتوكول هو معدل المشبك الأنسولين المستخدمة. كنا 7.5 معدل مو/كغ/دقيقة المشبك الذي يعتبر المرجع الفسيولوجية. استناداً إلى هذه الدراسة، يمكن استخدام معدل المشبك الأنسولين أقل (على سبيل المثال 3 مو/كغم/دقيقة).
في حين أننا وجدنا في بروتوكول وصف موثوق بها، وهناك القيود المحددة التي تحتاج إلى اهتمام. وهناك حالات عند قياس قطر الشرايين ليس الحل الأمثل. تنفيذ خطوات التحضير يتطلب بعض الخبرة مع النموذج. من الأهمية بمكان أن لا تسرب زيت البارافين من بيئة السفينة المكملة لها مع النفط الجديدة سوف تخل بالسفينة وتغيير القطر، مما يجعل من الضروري ترك بقية الشريان لآخر 30 دقيقة. وبالإضافة إلى ذلك، كان في بعض الأحيان انعكاسا للضوء (كما هو موضح في الخطوة 1، 14 من البروتوكول) على سطح زيت البارافين مشرقة جداً، مما يجعل من الصعب على عرض الشريان. يمكن التصدي لذلك بتوجيه مصدر الضوء حتى أن يسقط الضوء بزاوية لزيت البارافين السطحية ومواز للشريان.
وفي الختام، مزيج تقنيات سويس وناقلات الأمراض الوارد وصفها في هذه الدراسة يجعل من الممكن لقياس الآثار المختلفة للأنسولين على مختلف المستويات للمفرج. ناقلات الأمراض الشريان مرهف ثاقبة التغييرات الوعائية المنبع المساهمة في المصب نضح microvascular تقاس باستخدام سويس. ندعو إلى الجمع بين العديد من التقنيات التجريبية في الماوس نفسه على نحو أفضل تقييم وظيفة الأوعية الدموية.
Disclosures
البصرية وشركة سياتل تغطية رسوم الوصول المفتوح، بينما ظل هيكل ومحتوى المادة المسؤولية الكاملة للمؤلفين.
Acknowledgments
ونحن نشكر جي. غرون van دنكان لبرمجة برمجيات تحليل الصورة (إيماجيجرابير) المستخدمة في هذه الدراسة. التمويل اللازم لهذه الأبحاث قد قدمت على منحة من "منظمة هولندا" "البحث العلمي" (منحة 016.136.372).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 Mice | Charles river | Mice used were bred in-house | |
| Vevo 2100 high-resolution ultrasound system | VisualSonics inc. | ||
| MS250 non-linear transducer | VisualSonics inc. | ||
| Vevo 2100 software | VisualSonics inc. | ||
| Ultrasound gel (Aquasonic 100, colourless) | CSP Medical | 133-1009 | Ultrasound gel used to transmit the ultrasound waves |
| Vortex | VWR international | 58815-234 | |
| Heating pad | Pantlab | ||
| Freestyle Precision Xceed | Abbott | To measure blood glucose level during the hyperinsulinemic-euglycemic clamp | |
| Insulin Novorapid | Novo Nordisk | ||
| Glucose monohydrate | Merck Millipore | 1083421000 | |
| Buffered saline solution | B. Braun | 152118062 | |
| PE-20 medical tubing | Becton, Dickinson and Company | 427405 | |
| Needle, 27 Gauge | Becton-Dickinson & Co | 305109 | |
| Medical tape | 3M | ||
| Ultrasound probe holder | Built In-house | ||
| Cotton swabs | Multiple Equivalent | ||
| Creme depilator | Multiple Equivalent | ||
| Gel tissue adhesive | Derma+flex | GA30005-2222 | |
| Infusion pump | Harvard Apparatus | Harvard Apparatus PHD 2000 | |
| Small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Straight forceps with fine tip | Fine Science Tools (FST) | 11251-20 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX12 | |
| Camera | Basler | scA1390-17gc | |
| Image Grabber program | Built in-house | Image acquisition system | |
| Timer | VWR | 33501-418 | |
| Syringes, 1 mL | Fisher | 14-817-25 | |
| Light source, fiber-optic | Schott | KL1500 | Ideally has adjustable arms |
| Paraffin oil | Multiple Equivalent | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microbubbles | |||
| 1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| polyoxyethylene stearate | Sigma | p3440 | |
| perfluorobutane gas | F2 Chemicals | C4F10(g) | |
| Decon FS200 ultrasonic bath | Decon Ultrasonics Ltd | ||
| Vialmix | Lantheus Medical Imaging | 515370-0810 | |
| Multisizer Coulter Counter | Beckman Coulter Inc |
References
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Rowe, J. W., Andres, R. Glucose intolerance in uremia. Quantification of pancreatic beta cell sensitivity to glucose and tissue sensitivity to insulin. The J Clin Invest. 62, 425-435 (1978).
- Chiu, J. D., et al. Direct administration of insulin into skeletal muscle reveals that the transport of insulin across the capillary endothelium limits the time course of insulin to activate glucose disposal. Diabetes. 57, 828-835 (2008).
- Herkner, H., et al. Transcapillary insulin transfer in human skeletal muscle. Eur J Clin Invest. 33, 141-146 (2003).
- Yang, Y. J., Hope, I. D., Ader, M., Bergman, R. N. Insulin transport across capillaries is rate limiting for insulin action in dogs. J Clin Invest. 84, 1620-1628 (1989).
- Clerk, L. H., et al. The vasodilatory actions of insulin on resistance and terminal arterioles and their impact on muscle glucose uptake. Diabetes Metab Res Rev. 20, 3-12 (2004).
- Vincent, M. A., et al. Microvascular recruitment is an early insulin effect that regulates skeletal muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 53, 1418-1423 (2004).
- Barrett, E. J., et al. The vascular actions of insulin control its delivery to muscle and regulate the rate-limiting step in skeletal muscle insulin action. Diabetologia. 52, 752-764 (2009).
- Vincent, M. A., Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G., Barrett, E. J. Active role for the vasculature in the delivery of insulin to skeletal muscle. Clin Exp Pharmacol Physiol. 32, 302-307 (2005).
- Clark, M. G., Rattigan, S., Barrett, E. J., Vincent, M. A. Point: There is capillary recruitment in active skeletal muscle during exercise. J Appl Physiol (1985). 104, 889-891 (2008).
- Wallis, M. G., et al. Insulin-mediated hemodynamic changes are impaired in muscle of Zucker obese rats. Diabetes. 51, 3492-3498 (2002).
- Eringa, E. C., Stehouwer, C. D., Roos, M. H., Westerhof, N., Sipkema, P. Selective resistance to vasoactive effects of insulin in muscle resistance arteries of obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 293, 1134-1139 (2007).
- Bonner, J. S., et al. Muscle-specific vascular endothelial growth factor deletion induces muscle capillary rarefaction creating muscle insulin resistance. Diabetes. 62, 572-580 (2013).
- Kubota, T., et al. Impaired insulin signaling in endothelial cells reduces insulin-induced glucose uptake by skeletal muscle. Cell Metab. 13, 294-307 (2011).
- Levy, B. I., et al. Impaired tissue perfusion: a pathology common to hypertension, obesity, and diabetes mellitus. Circulation. 118, 968-976 (2008).
- Schelbert, H. R. Coronary circulatory function abnormalities in insulin resistance: insights from positron emission tomography. J Am Coll Cardiol. 53, 3-8 (2009).
- Wong, T. Y., et al. Associations between the metabolic syndrome and retinal microvascular signs: the Atherosclerosis Risk In Communities study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45, 2949-2954 (2004).
- Bonadonna, R. C., et al. Role of tissue-specific blood flow and tissue recruitment in insulin-mediated glucose uptake of human skeletal muscle. Circulation. 98, 234-241 (1998).
- Ellmerer, M., et al. Reduced access to insulin-sensitive tissues in dogs with obesity secondary to increased fat intake. Diabetes. 55, 1769-1775 (2006).
- Ellmerer, M., et al. Physiological hyperinsulinemia in dogs augments access of macromolecules to insulin-sensitive tissues. Diabetes. 53, 2741-2747 (2004).
- Vincent, M. A., et al. Mixed meal and light exercise each recruit muscle capillaries in healthy humans. Am J Physiol Endocrinol Metab. 290, 1191-1197 (2006).
- de Jongh, R. T., Serne, E. H., RG, I. J., de Vries, G., Stehouwer, C. D. Impaired microvascular function in obesity: implications for obesity-associated microangiopathy, hypertension, and insulin resistance. Circulation. 190, 2529-2535 (2004).
- Ketel, I. J., et al. Obese but not normal-weight women with polycystic ovary syndrome are characterized by metabolic and microvascular insulin resistance. J Clin Endocrinol Metab. 93, 3365-3372 (2008).
- Khan, F., et al. Impaired microvascular function in normal children: effects of adiposity and poor glucose handling. J Physiol. 551, 705-711 (2003).
- Clark, M. G. Impaired microvascular perfusion: a consequence of vascular dysfunction and a potential cause of insulin resistance in muscle. Am J Physiol Endocrinol Metab. 295, 732-750 (2008).
- Serne, E. H., et al. Impaired skin capillary recruitment in essential hypertension is caused by both functional and structural capillary rarefaction. Hypertension. 38, 238-242 (2001).
- Sriramarao, P., Anderson, W., Wolitzky, B. A., Broide, D. H. Mouse bone marrow-derived mast cells roll on P-selectin under conditions of flow in vivo. Lab Invest. 74, 634-643 (1996).
- Leister, I., et al. A peritoneal cavity chamber for intravital microscopy of the liver under conditions of pneumoperitoneum. Surg Endosc. 17, 939-942 (2003).
- Cardinal, T. R., et al. Chronic hindlimb ischemia impairs functional vasodilation and vascular reactivity in mouse feed arteries. Front Physiol. 2, 91 (2011).
- Duling, B. R. The preparation and use of the hamster cheek pouch for studies of the microcirculation. Microvasc Res. 5, 423-429 (1973).
- Wei, K., et al. Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of microbubbles administered as a constant venous infusion. Circulation. 97, 473-483 (1998).
- Clerk, L. H., Rattigan, S., Clark, M. G. Lipid infusion impairs physiologic insulin-mediated capillary recruitment and muscle glucose uptake in vivo. Diabetes. 51, 1138-1145 (2002).
- Barrett, E. J., Keske, M. A., Rattigan, S., Eringa, E. C. CrossTalk proposal: De novo capillary recruitment in healthy muscle is necessary. J Physiol. 592, 5129-5131 (2014).
- Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, 2728-2738 (2012).
- Boer, M. P., et al. Globular adiponectin controls insulin-mediated vasoreactivity in muscle through AMPKalpha2. Vascul Pharmacol. 78, 24-35 (2016).
- van den Brom, C. E., et al. Myocardial Perfusion and Function Are Distinctly Altered by Sevoflurane Anesthesia in Diet-Induced Prediabetic Rats. J Diabetes Res. 2016, 5205631 (2016).
- Meijer, R. I., et al. Perivascular adipose tissue control of insulin-induced vasoreactivity in muscle is impaired in db/db mice. Diabetes. 62, 590-598 (2013).
- Meijer, R. I., et al. Insulin-induced changes in skeletal muscle microvascular perfusion are dependent upon perivascular adipose tissue in women. Diabetologia. 58, 1907-1915 (2015).
- Sun, D., Kaley, G., Koller, A. Characteristics and origin of myogenic response in isolated gracilis muscle arterioles. Am J Physiol. 266, 1177-1183 (1994).
- Jonk, A. M., et al. Microvascular dysfunction in obesity: a potential mechanism in the pathogenesis of obesity-associated insulin resistance and hypertension. Physiology (Bethesda). 22, 252-260 (2007).
- Wiernsperger, N., Nivoit, P., De Aguiar, L. G., Bouskela, E. Microcirculation and the metabolic syndrome. Microcirculation. 14, 403-438 (2007).
- Horber, F. F., et al. Isoflurane and whole body leucine, glucose, and fatty acid metabolism in dogs. Anesthesiology. 73, 82-92 (1990).
- Sui, H., et al. Quantifying insulin sensitivity and entero-insular responsiveness to hyper- and hypoglycemia in ferrets. PLoS One. 9, 90519 (2014).
- Pires, N. M., et al. Local perivascular delivery of anti-restenotic agents from a drug-eluting poly(epsilon-caprolactone) stent cuff. Biomaterials. 26, 5386-5394 (2005).
- Young, D. A., Chi, M. M., Lowry, O. H. Energy metabolism of skeletal muscle biopsies stimulated anaerobically without load in vitro. Am J Physiol. 250, 813-820 (1986).
