Descreve-se um método para rotulagem de xenoenxertos estável derivado do doente (PDXs) com partículas lentivirais que expressam a proteína e repórteres de luciferase fluorescente verde. Este método permite acompanhar o crescimento de PDXs no sítio primário, bem como a detecção de metástases espontâneas e experimentais que utilizam em sistemas de imagem in vivo.
The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.
O desenvolvimento de xenoenxertos de tumor derivadas de doentes (PDXs), onde as amostras de tumor cirurgicamente ressecado são enxertadas directamente em ratinhos imunocomprometidos, oferece várias vantagens em relação a modelos de xenoenxerto padrão de linha de célula, e representa um avanço importante na investigação do cancro 1,2. PDXs pode ser mantido e ampliado por passagens sucessivas com alteração mínima das características genéticas e biológicas do tumor cresceu na primeira passagem; e reflectir com maior precisão do que a heterogeneidade do tumor xenotransplantes derivados de linhas celulares de cancro humano 3-8. Estes modelos são agora amplamente utilizado como uma plataforma para personalizar cancro terapêutica 9,10, como uma plataforma pré-clínico no desenvolvimento de medicamentos 6,11 e como uma ferramenta experimental para o estudo da biologia do câncer 4,12.
A maioria dos PDXs são implantados e propagadas por via subcutânea, o que permite viabilizar medição do crescimento do tumor ao longo do tempo utilizando um compasso. Contudo, Doença metastática tem sido mais difíceis de modelar utilizando PDXs. Especificamente para o cancro da mama, xenotransplantes com capacidade metastática a diferentes órgãos foram descritas 3,5,13, mas a freqüência de divulgação espontânea para sítios metastáticos é extremamente baixo. Onde relatado, a identificação e quantificação de carga metastático confia no exame histológico laboriosa de órgãos-alvo post-mortem. linhas celulares de cancro que expressam bioluminescente (luciferase, Luc) ou fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) repórteres genes são comumente usados em modelos experimentais de metástases do cancro da mama para o cérebro, pulmão, ossos e fígado após intracardíaca, tail-veia, intrafemoral e injeção do baço 14-16. Embora estes modelos ignorar disseminação de tumores primários, eles são valiosos para estudar os mecanismos de tropismo do órgão e colonização metastático. No entanto, as células derivadas de tumores de pacientes primários e PDXs pode ter baixa transfecção ou taxas de transdução de using procedimentos padrão. Uma alternativa é estabelecer linhas celulares derivadas PDX-17 in vitro, que pode ser, em seguida, marcada utilizando protocolos de cultura de tecidos convencionais. Esta abordagem, no entanto, não é adequado para etiquetar a maioria dos PDXs, para a qual linha celular de derivação é difícil e pode alterar o fenótipo das células. Aqui é apresentado um protocolo para a transdução de células tumorais dissociadas com PDX-lentivirais adequados para imagiologia in vivo. Além disso, descrevemos a metástase experimental com injeção intracardíaca de células PDX luc-GFP rotulados dissociados em ratinhos imunocomprometidos.
Um protocolo de base para a transdução de Organóides PDX-dissociáveis por gene-repórter que expressa lentivírus foi anteriormente descrito 18. No protocolo corrente que descrevem métodos adicionais para enriquecer em células de tumores humanos e obter perto de 100% de eficiência de transdução, bem como o uso de PDXs marcados para a detecção de cancro da mama experimentalmetástases. Este protocolo pode ser adaptado para a marcação de vários tipos de cancro da PDXs com vários marcadores luminescentes e fluorescentes, bem como na modulação da expressão do gene (ou seja, shRNA knockdown de genes de interesse).
As etapas críticas no âmbito do protocolo:
O uso de partículas lentivirais de título elevado (> 10 8 TU / ml) é um passo crítico no sucesso deste protocolo, como permite o controle cuidadoso da composição do meio durante a transdução in vitro. Embora vários métodos para a produção de partículas virais de título elevado têm sido bem descritos 18,19; este protocolo utiliza partículas lentivirais produzidos como descrito em de…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem ao Dr. Darrel Kotton na Universidade de Boston para fornecer o fago-EF1aL-dsRed-UBC-GFP-W vector e protocolos para a produção lentiviral título elevado usado nestes estudos. Este trabalho foi financiado pelo DOD BCRP W81XWH-11-1-0101 (DMC), ACS IRG # 57-001-53 (DMC), NCI K22CA181250 (DMC) e R01 CA140985 (CAS) concessão .NCI P30CA046934 Centro suportado in vivo de imagens e cultura de tecidos núcleos na Universidade do Colorado AMC.
DMEM/F12 (1:1) | Hyclone | SH30023.01 | |
bFGF | BD Biosciences | 354060 | |
EGF | BD Biosciences | 354001 | |
Heparin | Sigma | H4784 | |
B27 | Gibco/Thermo Fisher | 17504-44 | |
Anti-fungi-antibiotics | Hyclone | SV30010 | |
Accumax | Innovative Cell Technologies | AM-105-500 | Digestion Buffer |
FBS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
HBSS Red Ca++/Mg++ free | Hyclone | SH30031.02 | |
Hepes | |||
10X PBS | Hyclone | SH30258.01 | |
Cultrex | Cultrex | 3433-005-01 | Basement Matrix Extract (BME) |
30C shaker | NewBrunswick Scientific CO. INC | Series 25 Incubator Shaker | |
70um filters | Falcon | 7352350 | |
scalpels | Fisher | 22079690 | |
Clorhexidine disinfectant | Durvet | NDC# 30798-624-35 | |
Red blood cell lysis reagent | Sigma | R7757 | |
Neuraminidase | Sigma | N7885-1UN | |
EpCAM (CD326+) microbeads* | Miltenyil Biotec | 130-061-101 | |
Lineage cell depletion Kit, mouse* | Miltenyil Biotec | 130-090-858 | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | |
Mini MACS Magnetic Stand | Miltenyil Biotec | 130-042-303 | |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | MS or LS columns can be used, adjust to number of cells. |
Illumatool Tunable light system | Lightools research | Various | For in vivo fluorescence imaging |
Xenogen IVIS200 imaging device | Xenogen | Various | For in vivo luminiscence imaging |
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody | DAKO | M0821 | Pan-cytokeratin |
Epidermal Growth factor receptor antibody | Cell signaling | 4267S | EGFR |