Merking av brystkreftpasient-avledet xenografter med Spor Reporters for tumorvekst og metastase Studier

Summary

Vi beskriver en metode for stabil merking av pasient avledet xenografter (PDXs) med lentiviral partikler uttrykker grønt fluorescerende protein og luciferase journalister. Denne metoden gjør det mulig for sporing vekst av PDXs på det primære stedet, samt å oppdage spontane og eksperimentelle metastaser ved hjelp av in vivo imaging-systemer.

Abstract

The use of preclinical models to study tumor biology and response to treatment is central to cancer research. Long-established human cell lines, and many transgenic mouse models, often fail to recapitulate the key aspects of human malignancies. Thus, alternative models that better represent the heterogeneity of patients’ tumors and their metastases are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models in which surgically resected tumor samples are engrafted into immunocompromised mice have become an attractive alternative as they can be transplanted through multiple generations,and more efficiently reflect tumor heterogeneity than xenografts derived from human cancer cell lines. A limitation to the use of PDXs is that they are difficult to transfect or transduce to introduce traceable reporters or to manipulate gene expression. The current protocol describes methods to transduce dissociated tumor cells from PDXs with high transduction efficiency, and the use of labeled PDXs for experimental models of breast cancer metastases. The protocol also demonstrates the use of labeled PDXs in experimental metastasis models to study the organ-colonization process of the metastatic cascade. Metastases to different organs can be easily visualized and quantified using bioluminescent imaging in live animals, or GFP expression during dissection and in excised organs. These methods provide a powerful tool to extend the use of multiple types of PDXs to metastasis research.

Introduction

Utviklingen av pasient avledet tumorxenotransplantater (PDXs), hvor kirurgisk resected tumorprøver er innpodet direkte inn med svekket immunforsvar mus, har flere fordeler i forhold til standard celle linjer xenograft modeller, og representerer et stort fremskritt i kreftforskning ^1,2. PDXs kan opprettholdes og utvides ved suksessive passasjer med minimal endring av de genetiske og biologiske karakteristika for tumor dyrket ved den første passasjen; og mer nøyaktig reflektere svulst heterogenitet enn xenografter avledet fra humane kreftcellelinjer ^3-8. Disse modellene er nå mye brukt som en plattform for å tilpasse kreftbehandling ^9,10, som en preklinisk plattform i legemiddelutvikling ^6,11 og som en eksperimentell verktøy for å studere kreft biologi ^4,12.

De fleste PDXs blir implantert og spredte subkutant, som praktisk mulig tillater måling av tumorvekst over tid ved hjelp calipers. derimot, Metastatisk sykdom har vært vanskeligere å modellere ved hjelp PDXs. Spesielt for brystkreft, xenografter med metastaserende kapasitet til ulike organer har blitt beskrevet ^3,5,13, men frekvensen av spontan spredning til metastaser er ekstremt lav. Hvor rapportert, identifisering og kvantifisering av metastatisk belastning avhenger i møysommelige histologisk undersøkelse av målorganer post-mortem. Kreftcellelinjer som uttrykker bioluminescent (luciferase, Luc) eller fluoriserende (grønt fluorescerende protein, GFP) genet journalister blir ofte brukt i eksperimentelle modeller av brystkreft metastaser til hjernen, lungene, bein og lever etter intrakardiell, hale-vene, intrafemoral og milten injeksjon ^14-16. Selv om disse modellene omgå formidling fra de primære svulster, de er verdifulle for å studere mekanismene for orgel tropisme og metastatisk kolonisering. Imidlertid kan celler avledet fra primære pasientsvulster og PDXs har lav transfeksjon eller transduksjon priser using standard fremgangsmåter. Et alternativ er å etablere PDX-avledede cellelinjer in vitro ^17, som kan deretter merkes ved hjelp av konvensjonelle vevskultur protokoller. Denne fremgangsmåten er imidlertid ikke egnet for merking av de fleste PDXs, hvor cellelinje avledning er vanskelig og kan endre fenotypen av cellene. Her presenterer vi en protokoll for transduksjon av PDX-dissosierte tumorceller med lentivirale vektorer som er egnet for in vivo avbildning. I tillegg beskriver vi eksperimentelle metastase ved hjelp intrakardiell injeksjon av dissosierte luc-GFP merket PDX celler hos immunsupprimerte mus.

En grunnleggende protokollen for transduksjon av PDX-dissosierte organoids med gen-reporter som uttrykker lentivirus har tidligere blitt beskrevet ^18. I den nåværende protokoll beskriver vi flere metoder for å anrike for humane tumorceller og oppnår nesten 100% effektivitet transduksjon, så vel som anvendelse av merkede PDXs for detektering av eksperimentell brystkreftmetastaser. Denne protokollen kan tilpasses for merking av flere cancertyper PDXs med ulike selvlysende og fluorescerende markører, så vel som modulering av gen-ekspresjon (dvs. shRNA knockdown av gener som er av interesse).

Protocol

Alle trinn som krever bruk av dyr i denne protokollen følger retningslinjene fra University of Colorado dyr forskningsetisk komité (IACUC). 1. Utarbeidelse av instrumenter, Culture Media og andre reagenser Fremstille 100 ml mammosphere medium inneholdende Dulbeccos modifiserte Eagle-medium og Han F-12 medium (DMEM / F12) (1: 1), basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF, 20 ng / ml), epidermal vekstfaktor (EGF 10 ng / ml ), heparin (4 ug / ml), 1x B27, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml). …

Representative Results

Denne metoden beskriver transduksjon av PDX-dissosierte brystkreft celler med høy titer lentiviral vektorer pSIH1-H1-copGFP-T2A-puro og fag-EF1aL-luciferase-UBC-GFP-W. Disse vektorene uttrykker en fluoriserende markør som gjør det mulig å beregne effektiviteten av overføring in vitro, så tidlig som 24 timer etter infeksjon (figur 1a). For de fleste PDXs, vil ekspresjon av GFP bli forsinket inntil 72 timer etter infeksjon (figur 1b), ved de…

Discussion

Kritiske trinnene i protokollen:

Bruk av høy titer lentiviral partikler (> 10 ⁸ TU / ml) er et kritisk punkt i suksessen til denne protokollen, som tillater nøye kontroll av media sammensetning i løpet av in vitro transduksjon. Mens flere metoder for produksjon av høy-titer viruspartikler har blitt godt beskrevet ^18,19; denne protokollen bruker lentivirale partikler produsert som beskrevet i detalj i det <a href="http://www.kottonlab.com…

Materials

DMEM/F12 (1:1)	Hyclone	SH30023.01
bFGF	BD Biosciences	354060
EGF	BD Biosciences	354001
Heparin	Sigma	H4784
B27	Gibco/Thermo Fisher	17504-44
Anti-fungi-antibiotics	Hyclone	SV30010
Accumax	Innovative Cell Technologies	AM-105-500	Digestion Buffer
FBS	Atlanta Biologicals	S11550
HBSS Red Ca++/Mg++ free	Hyclone	SH30031.02
Hepes
10X PBS	Hyclone	SH30258.01
Cultrex	Cultrex	3433-005-01	Basement Matrix Extract (BME)
30C shaker	NewBrunswick Scientific CO. INC	Series 25 Incubator Shaker
70um filters	Falcon	7352350
scalpels	Fisher	22079690
Clorhexidine disinfectant	Durvet	NDC# 30798-624-35
Red blood  cell lysis reagent	Sigma	R7757
Neuraminidase	Sigma	N7885-1UN
EpCAM (CD326+) microbeads*	Miltenyil Biotec	130-061-101
Lineage cell depletion Kit, mouse*	Miltenyil Biotec	130-090-858
MiniMACS Separator	Miltenyil Biotec	130-042-102
Mini MACS Magnetic Stand	Miltenyil Biotec	130-042-303
MS Columns	Miltenyil Biotec	130-042-201	MS or LS columns can be used, adjust to number of cells.
Illumatool Tunable light system	Lightools research	Various	For in vivo fluorescence imaging
Xenogen IVIS200 imaging device	Xenogen	Various	For in vivo luminiscence imaging
Human Cytokeratin Clone MNF116 Monoclonal antibody	DAKO	M0821	Pan-cytokeratin
Epidermal Growth factor receptor antibody	Cell signaling	4267S	EGFR