Summary
このプロトコルは、MRIと全心心筋組織の3次元比較するための新規な方法を説明します。これは、心筋梗塞の慢性ブタモデルの梗塞境界域における心筋内注射の正確な評価のために設計されています。
Abstract
心臓再生治療は、虚血性心疾患の患者で負傷心を保護し、修復することを目指しています。幹細胞または梗塞境界域（IBZ）にangio-又は脈管形成を増強する他の生物学的製剤を注入することにより、組織灌流が向上し、心筋をさらなる損傷から保護することができます。最大の治療効果を得るために、再生物質が最高IBZに配信されると仮定されます。これは、正確な注射を必要とし、新たな注入技術の開発につながっています。これらの新しい技術を検証するために、我々は、心筋組織の分析に基づいて検証プロトコルを設計しています。このプロトコルは、詳細な二次元（2D）および心臓の解剖学的構造と心筋内注射の3次元（3D）解析を可能にする全心臓の心筋組織処理を含みます。ブタにおいて、心筋梗塞は、左冠動脈前下行枝の90分間の閉塞により作成されました。 4週間後、MIXT超常磁性酸化鉄粒子（SPIOs）および蛍光ビーズを有するヒドロゲルのUREは、低侵襲性心内膜アプローチを使用して、IBZに注入しました。 1時間の注入手順の後、ブタを安楽死させ、心臓を切除し、アガロース中に埋め込まれた（寒天）。寒天が固化した後に、磁気共鳴画像（MRI）、心臓のスライス、および蛍光イメージングを行いました。画像後処理後、3D分析がIBZターゲティング精度を評価するために行きました。このプロトコルは、IBZ中への心筋内注射のターゲティング精度の評価のための構造と再現性のある方法を提供します。瘢痕組織および/または心臓全体の噴射精度の検証の処理が望まれる場合にプロトコルを容易に使用することができます。
Introduction
虚血性心疾患は、過去数十年の1のために死の世界の主要な原因となっていました。心筋梗塞後の急性期治療は、経皮的冠動脈インターベンションまたは冠動脈バイパス術を経由して 、心筋への血流を回復することを目指しています。重度の梗塞では、心筋の大面積が傷され、これらのケースは、多くの場合、虚血性心不全（HF）2をもたらします。 HF予防に焦点を当て、HF患者の心機能の維持のための現在の治療選択肢ではなく、再生に関する。
この10年間、心臓再生治療は、HF 3のための治療選択肢として検討されています。この治療法は、血管再生、心筋細胞の保護、分化を誘導するために、直接怪我を心筋には、そのような幹細胞や成長因子などの生物学的製剤を、提供することを目指し、成長4。最適のための治療効果は、生物は、生物の生存のために、ターゲット・ゾーン5,6に最適な効果のための良好な組織灌流を容易にするために、梗塞境界域（IBZ）に注入されなければならないと仮定されます。複数の技術は、心筋内注射の7、8、9、10、11を案内するIBZの識別および可視化を行うために開発されてきました。 IBZの識別および可視化に加えて、送達も使用生体材料および注入カテーテルに依存しています。送達技術の噴射精度を検証するために、正確かつ再現可能な定量方法が要求されます。
我々は、全心臓の心筋組織の2次元（2D）を提供しています処理と三dimensioためのプロトコルを開発しました定性的および定量的研究のために使用することができるNAL（3D）イメージングは、目的としています。プロトコルは、埋め込み処理及びデジタル画像解析をカバーします。本稿では、慢性心筋梗塞の大ブタモデルにおけるIBZにおける心筋内注射の標的に正確さを評価するためのプロトコルを示しています。
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Protocol
in vivoでの実験は、実験動物研究所により調製実験動物の管理と使用に関する指針に従って実施しました。実験は、地元の動物実験委員会によって承認されました。
注射と埋め込みソリューションの調製
- 注射用ゲルを準備します。
- 前述のプロトコル12,13に応じてウレイド-ピリミジノン（UPy）ゲル1mLのを準備します。
- 15μgの/ mLの濃度を取得し、均一な分布のために5分間混合物を撹拌した溶液に超常磁性酸化鉄粒子（SPIOs）を加えます。
- 万個のビーズ/ mLの濃度を取得し、均一な分布のために5分間混合物を撹拌した溶液に、蛍光マイクロビーズを加えます。
- 暗い環境で得られた混合物を室温で保管してください。暖かく、ボルテックスまたは攪拌トンまもなく注入手順の前に、彼は、ソリューション。
- 埋め込みソリューションを準備します。
- 室温で水道水で開始し、4重量％の濃度になるようにアガロース（寒天）を加えます。
- ゆっくりマイクロ波オーブンを用いて沸点まで溶液を加熱し、加熱中に頻繁に撹拌しました。沸点に達すると、店舗及び閉じ込められた空気が表面にできるように2時間70℃以上の寒天溶液を保ちます。
- 寒天は、埋め込み時まで50〜60℃の間の温度に室温で冷却することを可能にします。
2.注入手順
- 以前に14を説明したように、前投薬（抗不整脈薬、抗血小板療法、および鎮痛薬）、麻酔、静脈アクセス、及び挿管を行います。
- 心筋内注入カテーテル（ 材料の表 ） を使用して注射を行います。各注入、0の場合。混合物の2mLを注射器を用いて約0.3 mL /分の一定速度で1回のボーラスで注入されます。 IBZ 12に沿った異なる位置で注射を置きます。
- 前に動物を安楽死へのガドリニウムベースの造影剤15分の0.2ミリリットル/キログラム（1.0ミリモル/ ml）を投与します。
- 静脈内に動物を安楽死させるために7.5％の塩化カリウムを20mLの管理。
- Koudstaal らによって記載されているように、8.3 -プロトコルは8.2ステップ以下縦隔のアクセスを確保します。 14。右心房から下大静脈5センチカットし、吸引装置で流出血液を除去。心を切除し、室温で0.9％生理食塩水でそれをすすいでください。
3.埋め込み手順
- 心の準備をします。
- そのまま心房と心室を維持しながら、心臓から心膜を削除します。 ±1センチメートルKlinkenbergを用いて大動脈弁の上に上行大動脈を解剖はさみ。心房から下大静脈に±1cmにカットして、肺静脈のために同じことを行います。
- プラスチック包埋容器（17×15×15センチ、幅×奥行×高さ）の埋め込み中に心臓の浮上を防止するために、2-0縫合糸を用いた（ 図1A）の底部に心尖を縫合。
- 心を中心とすることを確認し、容器（ 図1B）の壁に触れていない、2-0を使用して容器のリムに大動脈の残りの部分を縫合。
図1：概要図と埋め込みコンテナの写真。 （A）埋め込み処理の概略図。心臓（赤色）が縫合糸を使用して、コンテナ（青）に固定されます。寒天液で心を満たした後、心臓の周囲の空間が満たされています。最後に、2本の剛性プラスチックチューブ（黄色）は、画像登録時の基準として機能するように、心臓に接触次へではなく、容器内に配置されています。 （B）埋め込み容器内に固定心臓の写真。縫合糸は、蚊のクランプを使用して、容器のリムにクランプされます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
- 拡張末期のような形状で心を埋め込みます。
注：気泡生成の防止が必要です。大空気は寒天溶液中に存在する気泡場合、気泡が表面にできるように、40℃で、寒天を保ちます。- 蚊のクランプを使用して静脈下大をクランプします。右心房と心室の両方が完全に満たされるまで、ゆっくりと優れた大静脈血管を介して右心房に50-mLのシリンジを用いて液体寒天を注入します。
- mosquitを使用して肺静脈をクランプOクランプ。穏やかに大動脈弁を通して逆行寒天を充填した50mLのシリンジを通過させます。 LVおよび左心房が完全に満たされるまで、ゆっくりと左心室（LV）中の溶液を注入します。 LVを充填した後、LVに寒天を保つために大動脈をクランプします。
- 心が完全に覆われるまで容器に残った寒天を注ぎます。後で画像登録（ 図1A）のための参照構造として機能する埋め込み容器内に2本の剛性プラスチックチューブを置き。チューブは、コンテナや心臓の壁に触れないようにしてください。
- 7°C - 寒天は2で固化してみましょう。
4.画像取得
- 容器の中に埋め込まれた心臓の横断ex vivoで MRIスキャンを実行します。
- 頭部コイル内に埋め込まれ、心臓（ 材料の表 ）を有する容器を置き。
- スライスは、容器の底に平行Angulate。つかいます各ex vivoでのMRIシーケンスで同じ向きと角度。
- 心筋を視覚化するために、流体減衰反転回復以下のパラメータを有する（FLAIR）配列行う：繰り返し時間[TR] /エコー時間[TE] = 10秒/ 140秒、フリップ角= 90°、画素サイズ= 0.5×0.5 MM、ビュー[FOV] = 169 X 169ミリメートルの分野、320×320のマトリックス、及び3mmのスライス厚。
- [TR] / [TE] = 5.53 MS / 1.69ミリ秒、フリップ角= 25°、ピクセルサイズ= 1.0×1.0ミリメートル、[：心筋梗塞を視覚化するために、以下のパラメータで後期ガドリニウム増強（LGE）シーケンスを実行FOV = 169 X 169ミリメートル、176×176のマトリックス、及び3mmのスライス厚。
- - 24.6ミリ秒、フリップ角= 15°、画素[TR] / [TE] = 88.7 MS / 1.9の範囲が15に等しく分布のTE：SPIOsを視覚化するために、以下のパラメータを用いてT2 *強調グラディエントエコーシーケンスを実行サイズ= 0.5×0.5 mmで、[FOV] = 169 X 169ミリメートル、320×320のマトリックス、及び3mmのスライス厚。
- 組織プロセスへ歌う
- 逆さま容器を回して容器から、心臓を含む、固体寒天溶液を除去するために、寒天と容器の側面との間の空気を可能にします。固体寒天からプラスチック製の棒を取り外します。
- セクションスライサーを用いて心臓の基部の頂点から5 mmのスライスにおける心臓を含む寒天ブロック。寒天ブロックの底部と平行に切断することによって取得されたMR画像と同じカットスライスの角度を保ちます。
- 37℃での0.9％生理食塩水に溶解した2,3,5- triphenyltetrazoliumchloride（TTC）の1重量％で15分間（心臓を含む）寒天切片を染色し、垂直ビューから両側のスライスを撮影する（ 図2A）。次に、慎重に0.9％生理食塩水でスライスをすすぎます。
注：本研究では、適切なレンズ/目的としたデジタル一眼レフのセットアップ、三脚、かつ均一な照明を使用しました。しかし、写真だけで傷領域の評価のための制御を務め、私たちは、さまざまな設定を使用することもできました。
- 蛍光イメージング
注：あるので、選択された励起レーザー蛍光マイクロビーズの励起波長および発光波長に応じて、（ 例えば、ここで使用される赤のマイクロビーズを、それぞれ580 nmおよび605 nmでの励起および発光波長を有しているが、適切なフィルタブロックと励起レーザーを選択バンドパスフィルタは、532nmで、30分の580 nmおよび30分の610 nmで、それぞれ）に設定しました。- 可変モードスキャナの蛍光モードイメージングを選択します。 430 Vまたは同等の光電子増倍管と100×100ミクロンの画素サイズを設定します。蛍光マイクロビーズの励起波長に最も近い励起レーザー（532 nm）を選択します。
- 第一のフィルタブロックについて、注入蛍光ビーズ（チャネル1）の発光波長と重複するバンドパスフィルタ（30分の580 nm）を選択します。すなわち外側の第2フィルタ・ブロック（30分の610）のためのバンドパスフィルタを選択ミッション波長（チャンネル2）。
注：第二フィルタブロックが無傷の注射部位を維持しながら自家蛍光を除去するための陰性対照として機能し。 - 2つのチャネルを用いた可変モードレーザスキャナの蛍光モードで寒天のスライスの両面をスキャンします。各スライスが完全に基準穴を含め、スキャンされていることを確認します。
5.ポスト処理
注：画像後処理の最初のステップは、エンド - および心外膜の境界線だけでなく、注射部位をトレースするには、自社開発のスクリプトを使用して心筋の手動セグメンテーションです。これは、MRIおよび蛍光スキャンの両方で同じです。
- セグメントMRIスキャンにおける心筋。
- セグメントFLAIR MRIシーケンス画像上の心内膜および心外膜のルブ・ボーダーズ。
- LGE MRIシーケンスに傷ステップ5.1.1からLGE-MRIデータセットおよびセグメントにLVセグメンテーションをコピーします。。
- LV心筋における*強調データセットとセグメントSPIOの堆積T2にステップ5.1.1から心筋セグメンテーションをコピーします。
- 蛍光画像を処理してセグメンテーションを行います。
- 可変モードスキャナから得られたファイルをロードし、各断面心臓スライスの別の画像を作成します。
- 向きを頂点と頂点から基部に配向されている両方のチャンネルのためにスタックに蛍光画像をソートするベースでスキャンされたスライスを裏返し。
- 蛍光画像上のセグメント心内膜および心外膜のルブ・ボーダーズ。
- 蛍光画像上で手動セグメント瘢痕および瘢痕の形態を確認するために、LGE-MRIスキャン及び写真を使用。
- 自己蛍光を除外するために、チャネル1の画像スタックからチャネル2の画像スタックを引きます。手動セグメント蛍光マイクロビーズ沈着、確認のためにT2 *画像を使用しています。
- 作成するには解剖学的に正しい3Dジオメトリは、参照構造（硬質管によって作成された穴）に基づく画像スタック内のスライスの剛体位置合わせを行います。各画像の適用並進及び回転を計算して格納します。
- 画像スタックとセグメンテーションに格納された変換を適用します。直線元のスライス厚を再構築し、データの3Dモデルを作成するために、スライスの両側のセグメンテーションを補間します。
6.分析
- 注入精度を評価するために、注射部位とIBZの中心間距離の2Dおよび/または3D測定を行います。 LVセグメンテーションの心内膜の境界線に沿った距離を測定します。 図2C及び2Fに、2Dおよび3D測定の例は、赤線で示されています。
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Representative Results
組織の埋め込み
埋め込みプロセスを介して、拡張終期のような幾何学的形状は、確立されました。寒天は、正常等しいスライス厚（ 図2Aおよび2C）で所望の角度でスライスされるべき組織を可能にする、心臓組織に接着します。
Scar-と注射部位の評価
各撮像モダリティのため、梗塞および注入場所の評価が正常に行われました。両方の2D蛍光イメージング及びMRIイメージングでは、瘢痕および注射部位は（明らかに異なっていた。図2C、 図2D、および図2E、 それぞれ）。 TTC染色組織とLGE-MRI画像の写真は蛍光イメージングにおける瘢痕評価のための制御を提供する（ 図図2Aおよび2C）。
3D再構成
基準マーカは、画像レジストレーションのための正確で信頼性の高い方法を提供します。画像後処理は、セグメンテーションおよび心臓（ 図2F）の蛍光画像に基づいて、ex vivoで心臓の3D形状の再構成を可能にします。セグメンテーションの3Dジオメトリは、正確な3D噴射精度の評価（ 図2F）を可能にします。
測定
本研究では、注入の堆積とIBZは心内膜の壁に投影されました。その後、心内膜表面上の突起との間の距離が（ 図2Cおよび2F）を測定しました。高解像度（0.1×0.1 mm）の蛍光画像正確な測定を可能にしました。 3D再構成では、スライス厚によるZ方向の分解能2.5 mmでした。
図2： 典型的な 生体外 イメージングデータ及び3D再構成。このプロトコルで使用される異なるモダリティによって取得された結果の画像。すべての画像は、埋め込まれた心の同じ横方向のスライスを示しています。 （A）瘢痕が可視であるTTC染色切片の写真。 （B）の解剖学的構造の概略。合わせた両方のチャンネルを有する（C）蛍光画像。ビーズの発光スペクトルをカバーするチャネルは赤色で示され、陰性コントロールは緑色で示されています。赤い円は、注射部位を示します。注射からIBZまでの距離測定は、ウィットを示していますH赤線。 （D）短軸LGE-MRI。梗塞領域は超強烈な白い領域として示されています。 （E）T2 * -重み付けMRI;注入物質内のSPIO粒子は、赤い丸で示したローカル信号空隙として認識することができます。注射部位（赤）の（F）は、3D視覚化、瘢痕組織（白）、および心筋（緑色）蛍光画像にセグメント化されます。矢印は、CとEと同じ射出スポットを示しています。この画像では、同一の距離測定を赤線で示されています。 LV =左心室、RV =右心室。スケールバーは10ミリメートルを表しています。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルによれば、全心臓の3D心筋組織の処理は、梗塞、IBZ、心臓の解剖学的構造に対して行わ注射の3次元解析を可能にする構造化された方法を提供します。心臓の充填量は、所望の分析に依存します。本研究では、注入精度を評価するために、我々はできるだけ密接に拡張末期形状に似ていると心を埋めることを目的としました。これを強制するために、LVの頂点は、容器の底部に固定され、肺静脈がクランプされている間LV寒天が充填されています。 LVが充填されたときに、大動脈はLVの流出とできるだけ密接に拡張終期形状を模倣から寒天を防止するだけでなくクランプされます。埋め込まれた心臓の切片は、均一なスライス厚の利点を提供し、スライスがでex vivoでイメージングと同じ角度にすることを可能にします。スライス後、埋め込み材料は、による変形から組織を防止します画像取得時のスライスの取り扱い。染色は、代謝活性と-inactive組織を区別するために酵素に依存しているように、理想的には、TTC染色は、身体からの除去後にできるだけ早く行われるべきです。私たちのプロトコルでは、しかし、TTC染色が埋め込まれた心は、寒天を固化するために冷却されている埋め込み処理を含め、場所を取ることができる前に行われなければならないいくつかの重要なステップがあります。我々はすべてのスライスにおける梗塞組織の明確な染色を観察しているので、私たちは、この効果は最小であったと信じています。
ここで使用される撮像装置は、同じ機能を提供する別の装置に置き換えることができます。可変モードレーザスキャナと効果的かつ正確に組織を処理するために複数のフィルタブロックを設定するオプションの高分解能蛍光イメージングは、詳細な分析のために不可欠です。 PERFに完全な自由を許可する画像後処理、ソフトウェアパッケージのためのORMの画像解析が必要とされています。我々の経験では、注入精度の評価のための3次元解析が使用されますが、2D画像の解析も可能ですました。
我々はこれまでに10匹のブタでは、この心筋組織の処理方法を実行しており、118回の行わ注射の合計での注射部位の73％を見つけることができました。実行注射量と識別された注射部位の量の差は、おそらく5 mmのスライス厚と蛍光スキャナの1.5 MMMの侵入深さの差によって引き起こされます。理論的には、組織の2mmで、各スライスで測定されていません。シンナースライスは、この問題を解決するだろう。
制限事項
埋め込み処理の開始時に拡張末期のような形状にもかかわらず、いくつかの心は寒天で少し縮小しているように見えました。我々は拡張末期のボリュームからの大きな逸脱を認められていないので、私たちは、と信じていますこの効果は最小であったと注入精度評価に影響を与えませんでした。シンナー組織切片を使用すると、評価の精度を向上させ、ex vivoで MRIとのより詳細な比較を可能にします。別のオプションは、侵入深さおよびおそらく検出さフラクションを改善するために、NIRF剤の代わりに、蛍光マイクロビーズを使用することであろう。さらに、埋め込まれた心の低温とTTC染色のタイミングは、染色のこのタイプのために必要な酵素の欠如を引き起こす可能性があります。それにも関わらず、染色された切片の写真は、瘢痕評価のための良好な制御であることが判明しました。
今後の展望
この方法は、もともと心筋内注射の精度評価のために設計されていますが、他のエンドポイントとの研究も、この方法（ 例えば、梗塞サイズ、形態学的評価、または他の臓器）の恩恵を受けることができます。 MRIに加えて、例えばCTのような他の3D撮像モダリティ、PETまたはSPECTは、実証方法以下心筋組織上で使用することができます。加えて、これらの異なる撮像モダリティの統合は、おそらくさらに2Dを最適化でき、3D分析します。
結論
結論するために、我々は、3D全体の心臓の心筋組織の処理を実行するための新規な、標準化、および再現性のある方法を提供してきました。寒天は、所望の角度で、かつ同じ厚みでスライスされるべき組織を可能にする、全心臓の埋め込みに適した培地であることが判明しました。また、画像登録は、定性的および定量的研究を目的とするために使用することができる高空間分解能で三次元的な評価を可能にする、心筋撮像の3D再構成のために実行可能証明しました。
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Disclosures
著者は、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、動物実験とその支援のためマーライン・ジャンセン、ジョイスフィッセル、およびマルタインバンNieuwburgに感謝したいと思います。我々は大幅にMRI画像とその支援のためマルタインFroelingとアンケ・ウォッシンク認めます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | Braun | ||
| Agarose | Roche Diagnostics | Scientific grade multipurpose agar | |
| Biomolecular fluorescence scanner Typhoon 9410 | GE Healthcare | ||
| Embedding container | Plastic, dimensions 17 x 14.5 x 14 cm | ||
| FluoSpheres Polystyrene Microspheres | Invitrogen | F8834 | red, 10 µm |
| Gadolinium | Gadovist | 1.0 mmol/mL | |
| dS 32 channel head coil | Philips | Or similar | |
| Matlab | Mathworks | To insure compatability 2015a or newer | |
| Meat slicer | Berkel | ||
| Myostar injection catheter | Biosense Webster | ||
| Super paramagnetic iron oxide particles | Sinerem | ||
| Triphenyl-tetrazolium chloride | Merck | ||
| UPy-PEG10k | |||
| Vicryl 2-0 | Ethicon |
References
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