Protocollo sperimentale per il rilevamento<em> cianobatteri</em> In campioni liquidi e solidi con un anticorpo Microarray chip
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
Il riscaldamento globale e l'eutrofizzazione fanno alcuni ecosistemi acquatici si comportano come veri bioreattori che innescano la crescita dei cianobatteri rapida e massiccia; questo ha conseguenze economiche rilevanti sulla salute e. Molti ceppi di cianobatteri sono produttori di tossine, e solo poche cellule sono necessarie per indurre un danno irreparabile per l'ambiente. Pertanto, le autorità d'acqua del corpo e le amministrazioni richiedono sistemi di allarme precoce rapidi ed efficienti che forniscono dati affidabili per supportare le loro decisioni preventivo o curativo. Questo manoscritto riporta un protocollo sperimentale per la rilevazione sul campo di ceppi di cianobatteri produttori di tossine utilizzando un chip microarray anticorpo con 17 anticorpi (Abs) con risoluzione tassonomica (CYANOCHIP). Qui, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) per il monitoraggio simultaneo di 17 ceppi di cianobatteri frequente che fiorisce in ecosistemi d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine, è descritto. Un microarray con multiple replicati identici (fino a 24) del CYANOCHIP fu stampata su un unico vetrino per testare contemporaneamente un numero simile di campioni. Campioni liquidi possono essere testati mediante incubazione diretta con gli anticorpi (Abs) o dopo concentrazione cellulare mediante filtrazione attraverso un filtro da 1 a 3 micron. campioni solidi, come sedimenti e rocce macinate, vengono prima omogeneizzati e dispersi da un ultrasonicatore portatile in un tampone di incubazione. Essi vengono filtrati (i 5 – 20 micron) per rimuovere il materiale grossolano, e il filtrato viene incubato con Abs. Immunoreazioni sono rivelati da una incubazione finale con una miscela di 17 Abs fluorescenza etichettati e vengono letti da un rivelatore a fluorescenza portatile. L'intero processo richiede circa 3 ore, la maggior parte corrispondente a due periodi di 1 h di incubazione. L'uscita è un'immagine, in cui punti luminosi corrispondono alla rilevazione positiva di marcatori cianobatteri.
Introduction
Il rilevamento e il monitoraggio dei microrganismi in complesse comunità microbiche naturali sono fondamentali in molti campi, tra cui la biomedicina, l'ecologia ambientale, e astrobiologia. I cianobatteri sono microrganismi procarioti ben noti per la loro capacità di formare fioriture (eccessiva proliferazione) delle cellule in acqua dolce. Essi sono onnipresenti, e molte specie sono in grado di produrre tossine, che porta non solo ad un potenziale rischio per la salute umana, ma anche ad un impatto ecologico. A questo proposito, è essenziale sviluppare metodi rapidi e sensibili per la diagnosi precoce di cianobatteri e / o loro tossine nel suolo e acqua. A questo scopo, una fluorescente immunodosaggio a sandwich microarray multiplex (FSMI) è stato sviluppato come strumento per gestori delle risorse idriche per aiutarli a prendere decisioni e, di conseguenza, nella realizzazione dei programmi di gestione dell'acqua corretta.
Una vasta gamma di metodi è stato sviluppato per rilevare e identificare cianocellule obacterial e cianotossine nel suolo e acqua, tra cui la microscopia ottica, la biologia molecolare e tecniche immunologiche. Questi metodi possono variare notevolmente nelle informazioni che forniscono. Tecniche microscopiche sono basate sulla morfologia cellulare e la rilevazione della fluorescenza in vivo da pigmenti cianobatteri, come phycocyanin o clorofilla a 1. Anche se sono metodi rapidi ed economici per il tempo reale e il monitoraggio frequente che a seconda del tipo e del numero di cianobatteri presenti in un campione, non danno informazioni sulla potenziale tossicità. Inoltre, essi richiedono un certo livello di esperienza, considerando che spesso è molto difficile distinguere tra specie strettamente collegate 2. Per superare queste limitazioni, la microscopia ottica deve essere accompagnata da entrambi i test di screening biologici e biochimici e metodi fisico-chimiche per l'identificazione e la quantificazione di cianotossine.
<pclass = "jove_content"> enzimatico analisi immunoassorbimento (ELISA), test di inibizione della proteina fosfato (PPIA), e le prove neurochimiche nei topi sono esempi di test di screening biochimici per la rilevazione di cianotossine. Mentre i primi due sono metodologie rapide e sensibili, i falsi positivi sono stati descritti quando si utilizzano test ELISA e PPIA sono limitati a tre tipi di tossine. Il biotest sui topi è una tecnica qualitativa con una bassa sensibilità e precisione, e le licenze speciali e la formazione è necessaria. Inoltre, non dà informazioni sul tipo di tossine presenti in un campione. Cianotossine possono essere identificati e quantificati con altri metodi analitici, come la cromatografia liquida ad alta prestazione (HPLC), la spettrometria di cromatografia-massa liquida (LC-MS), gas cromatografia (GC), spettrometria di cromatografia di massa di gas (GC-MS), o matrice assistita laser tempo desorbimento / ionizzazione di volo (MALDI-TOF). Tuttavia, questo è possibile solo se gli standard di riferimento, che sono bisognoEd per determinare le concentrazioni di tossine individuali in campioni complessi, sono disponibili 3, 4. Inoltre, questi metodi sono molto tempo; richiedono attrezzature costose, forniture, e la preparazione del campione; e deve essere eseguita da personale esperto e specializzato.Metodi molecolari basati sono stati applicati per decenni per rilevare, identificare e quantificare cianobatteri e loro cianotossine corrispondenti grazie alle informazioni di sequenza pubblicata nelle banche dati del genoma (ad esempio, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Tra questi metodi sono quelli basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR), che richiede la definizione di serie di primer per l'amplificazione del DNA e dipendono dalla precedente conoscenza della sequenza di DNA di diverse specie di cianobatteri. Mentre la rilevazione del gene, come l'operone phycocyanin, porta ad accurata identificazione a livello di genere, alcune specie o ceppi sono rilevati conquesto metodo. Tuttavia, geni della tossina codificanti, come quelle appartenenti alla operone microcystin, facilitare l'identificazione di tossine in campioni in cui i produttori sono scarsi 5. Tuttavia, la rilevazione dei marcatori tossina mediante PCR non implica necessariamente tossicità nell'ambiente. Inoltre, la serie di primer sviluppati per analizzare l'intera gamma di specie di cianobatteri produttori e tossiche presenti in un campione è ancora incompleta, e ulteriori studi deve essere fatto per identificare specie sconosciute. Altre tecniche molecolari sono non-PCR-based, come ibridazione in situ fluorescente (FISH) e DNA microarray.
Negli ultimi due decenni, la tecnologia microarray ha acquisito importanza in molti campi di applicazione, in particolare nel monitoraggio ambientale. DNA microarray consentono di discriminazione tra le specie e gli analiti 4, 6, 7 </sup>, 8, 9, 10, ma sono considerati molto laborioso e richiede tempo compiti che coinvolgono più passaggi (ad esempio, prestazioni microarray, estrazione DNA, amplificazione PCR e ibridazione). Per questo motivo, meno saggi in termini di tempo basati su anticorpi, come panino e microarrays immunologici competitivi, sono diventati un metodo essenziale e affidabile ad alta produttività per la rilevazione di più analiti ambientali 11, 12, 13. La capacità degli anticorpi di riconoscere specificamente i loro composti target e rilevare piccole quantità di analiti e proteine, insieme alla possibilità di produrre anticorpi contro quasi ogni sostanza, rendono microarrays dell'anticorpo una tecnica potente per scopi ambientali. Inoltre, la capacità di realizzare analisi multiple comeassay ingle, con limiti di rilevazione vanno da ppb a ppm, è uno dei principali vantaggi di questo metodo 14.
Biosensori basati su anticorpi sono dimostrati strumenti sensibili e rapidi per la rilevazione di una vasta gamma di patogeni e tossine nel monitoraggio ambientale 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. Mentre i metodi del DNA coinvolgono diversi passaggi, i microarray a base di anticorpi richiedono solo una piccola preparazione del campione che si basa principalmente su un gradino lisi breve in un buffer soluzione adeguata. Delehanty e Ligler 15 riportato la rilevazione simultanea di proteine e analiti batteriche in miscele complesse sulla base di un test immuno-anticorpi a sandwich in grado di rilevare una concentrazione proteica di 4 ppb und 10 4 cfu / ml di cellule. Szkola et al. 21 hanno sviluppato un buon mercato e affidabile multiplex microarray per la rilevazione simultanea di proteotoxins e piccoli tossine, composti che possono essere utilizzati nella guerra biologica. Essi rivelò concentrazioni di tossina ricina, con un limite di rilevamento di 3 ppb, in meno di 20 min. Recentemente, la CYANOCHIP, un biosensore basato microarray anticorpi per il rilevamento in situ di cianobatteri tossici e non tossico, è stato descritto 22. Questo microarray consente l'identificazione di potenziali fioriture di cianobatteri, soprattutto in ambienti acquatici, che sono difficili da identificare microscopicamente. Il limite di rilevazione del microarray è di 10 marzo 2-10 cellule per la maggior parte delle specie, trasformando questo biosensore in uno strumento conveniente per il rilevamento e l'identificazione multiplex di cianobatteri, anche a livello di specie. Tutte queste caratteristiche rendono il Antibotecnica microarray dy, e in particolare il metodo presentato in questo lavoro, un metodo rapido e più semplice rispetto alle tecniche citate.
Questo lavoro presenta due esempi di esperimenti che utilizzano un biosensore microarray anticorpi per rilevare la presenza di cianobatteri in campioni di suolo e acqua. Si tratta di un metodo semplice ed affidabile basato su un formato di immunodosaggio a sandwich che richiede volumi di campioni molto piccoli e preparazione del campione molto semplice. Il metodo richiede poco tempo e può essere facilmente eseguita nel campo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, un multiplex a fluorescenza immunodosaggio a sandwich con il CYANOCHIP, un microarray 17-anticorpo per il rilevamento e l'identificazione di una vasta gamma di generi cianobatteri, è descritto 22. Questi cianobatteri rappresentano i generi bentonici e planctonici più frequente in habitat d'acqua dolce, alcuni dei quali produttori di tossine che sono. Recentemente, il formato a sandwich immunoassay fluorescente è stato usato per identificare i microrganismi e / o bioanalyt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dr. Antonio Quesada presso la Universidad Autónoma de Madrid per la fornitura di ceppi di cianobatteri. Questo lavoro è stato finanziato dalla Subdirección General de Proyectos de Investigación dello spagnolo Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), concede nessuna. AYA2011-24803 e ESP2014-58494-R.
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
