بروتوكول تجريبي للكشف<em> البكتيريا الزرقاء</em> في العينات السائلة والصلبة مع الأجسام المضادة ميكروأري رقاقة
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
ظاهرة الاحتباس الحراري وزيادة المغذيات جعل بعض النظم الإيكولوجية المائية تتصرف المفاعلات الحيوية الحقيقية كما أن يؤدي النمو السيانوبكتيريا السريع والهائل. هذا له الصحية ذات الصلة والعواقب الاقتصادية. العديد من السلالات السيانوبكتيريا والمنتجين السم، وفقط عدد قليل من الخلايا اللازمة للحث على ضرر لا يمكن إصلاحه للبيئة. لذلك، السلطات مائي والإدارات تتطلب نظم الإنذار المبكر السريعة والفعالة وتوفير بيانات موثوقة لدعم القرارات الوقائية أو العلاجية الخاصة بهم. تقارير هذه المخطوطة بروتوكول تجريبي للكشف في مجال سلالات السيانوبكتيريا المنتجة للسموم باستخدام ميكروأري رقاقة الأجسام المضادة مع الأجسام المضادة 17 (عبس) لقرار التصنيفية (CYANOCHIP). هنا، وتعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) لرصد وقت واحد من 17 سلالات السيانوبكتيريا في كثير من الأحيان وجدت تزهر في النظم الإيكولوجية للمياه العذبة، وبعضهم من المنتجين السم، وصفت. وميكروأري مع متعددةسبيل مكررات متطابقة (تصل إلى 24) من CYANOCHIP طبعت على شريحة المجهر واحدة لاختبار في وقت واحد عددا مماثلا من العينات. العينات السائلة يمكن اختبارها إما عن طريق حضانة مباشرة مع الأجسام المضادة (عبس) أو بعد تركيز خلية عن طريق الترشيح من خلال مرشح 1- إلى 3 ميكرون. العينات الصلبة، مثل الرواسب والصخور الأرض، ويتجانس الخليط الأول وفرقت من قبل ultrasonicator باليد في وجود مخزن مؤقت الحضانة. ثم يتم تصفيتها (5-20 ميكرون) لإزالة المواد الخشنة، وحضنت الترشيح مع القيمة المطلقة. وكشف Immunoreactions من قبل حضانة النهائية مع خليط من القيمة المطلقة مضان المسمى 17 ويتم قراءتها بواسطة جهاز الكشف عن مضان المحمولة. العملية كلها تستغرق حوالي 3 ساعات، أكثر من ذلك المقابلة لفترتين 1-ساعة من الحضانة. الإخراج هو صورة، حيث تتوافق النقاط المضيئة لكشف إيجابي من علامات السيانوبكتيريا.
Introduction
كشف ورصد الكائنات الحية الدقيقة في المجتمعات الميكروبية الطبيعية المعقدة حاسمة في العديد من المجالات، بما في ذلك الطب الحيوي والبيئة البيئية، والبيولوجيا الفلكية. البكتيريا الزرقاء هي الكائنات الحية الدقيقة بدائية النواة المعروفة لقدرتها على تشكيل تزهر (الانتشار المفرط) من الخلايا في المياه العذبة. انهم في كل مكان، والعديد من الأنواع قادرة على إنتاج السموم، مما يؤدي ليس فقط إلى خطر محتمل على صحة الإنسان، ولكن أيضا إلى التأثير البيئي. وفي هذا الصدد، لا بد من تطوير أساليب سريعة وحساسة للكشف المبكر من البكتيريا الزرقاء و / أو سمومها في التربة والمياه. لهذا الغرض، تم تطوير تعدد الإرسال الفلورسنت المناعية شطيرة ميكروأري (FSMI) كأداة لإدارة المياه لمساعدتهم في اتخاذ القرارات، وبالتالي، في تنفيذ البرامج المناسبة لإدارة المياه.
وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الطرق لاكتشاف وتحديد السماويخلايا obacterial وcyanotoxins في التربة والمياه، بما في ذلك المجهر الضوئي، والبيولوجيا الجزيئية، والتقنيات المناعية. هذه الأساليب يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في المعلومات التي يقدمونها. وتعتمد التقنيات المجهرية على شكل الخلية وكشف في الجسم الحي مضان من الأصباغ السيانوبكتيريا، مثل فيكوسيانين أو الكلوروفيل (أ) 1. على الرغم من أنها طرق سريعة ورخيصة في الوقت الحقيقي والرصد المتكرر لإعلام حول نوع وعدد من البكتيريا الزرقاء الموجودة في عينة، فإنها لا تعطي معلومات حول السمية المحتملة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنها تتطلب مستوى معين من الخبرة، معتبرا أنه غالبا ما يكون من الصعب جدا التمييز بين الأنواع ذات صلة وثيقة 2. للتغلب على هذه القيود، يجب أن يصاحب ضوء المجهر من قبل كل من فحوصات الكشف البيولوجية والكيميائية الحيوية والطرق الفيزيائية لتحديد وتقدير من cyanotoxins.
<pالطبقة = "jove_content"> انزيم مرتبط المقايسات المناعي (ELISA)، المقايسات البروتين الفوسفات تثبيط (PPIA)، والاختبارات الكيميائية العصبية في الفئران هي أمثلة على المقايسات فحص البيوكيميائية للكشف عن cyanotoxins. في حين أن الأولين هي المنهجيات السريعة والحساسة، وقد وصفت ايجابيات كاذبة عندما يتم تقييد استخدام ELISA وPPIA الاختبارات لثلاثة أنواع من السموم. الأحيائي الماوس تقنية نوعية مع انخفاض الحساسية والدقة، وترخيص خاص والتدريب هو مطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه لا يعطي معلومات حول نوع من السموم الموجودة في العينة. ويمكن تحديد Cyanotoxins وكميا بواسطة طرق أخرى تحليلية، مثل ارتفاع الأداء اللوني السائل (HPLC)، السائل الطيف اللوني الشامل (LC-MS)، اللوني للغاز (GC)، الغاز اللوني الكتلة الطيفي (GC-MS)، أو مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز الوقت / تأين الطيران (MALDI-TOF). ومع ذلك، وهذا ممكن فقط إذا المعايير المرجعية، والتي تحتاجإد لتحديد تركيز السم الفردية في عينات معقدة، وتتوفر 3 و 4. وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب هي مضيعة للوقت. تتطلب معدات مكلفة، واللوازم، وإعداد العينات. ويجب أن يقوم بها الموظفين ذوي الخبرة والاختصاص.طبقت على أساس أساليب الجزيئية لعقود من الزمن لكشف وتحديد، وتحديد البكتيريا الزرقاء وcyanotoxins المقابلة شكرهم للمعلومات تسلسل نشرت في قواعد بيانات الجينوم (على سبيل المثال، المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية، NCBI). ومن بين هذه الطرق هي تلك التي تستند إلى تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، الأمر الذي يتطلب تصميم مجموعات من الاشعال لتضخيم الحمض النووي وتعتمد على معرفة سابقة من تسلسل الحمض النووي من الأنواع السيانوبكتيريا مختلفة. في حين كشف الجينات مثل الاوبرون فيكوسيانين، يؤدي إلى تحديد دقيق على مستوى جنس، فإن بعض الأنواع أو السلالات هي التي لم يتم كشفها معهذه الطريقة. ومع ذلك، جينات ترميز السم، مثل أولئك الذين ينتمون إلى الاوبرون microcystin، تسهيل التعرف على السموم في العينات حيث المنتجين شحيحة 5. ومع ذلك، والكشف عن علامات السمية عن طريق PCR لا يعني بالضرورة سمية في البيئة. وعلاوة على ذلك، فإن مجموعة من الاشعال المتقدمة لتحليل مجموعة كاملة من الأنواع من البكتيريا الزرقاء والسمية المنتجين الحالي في عينة لا يزال غير مكتمل، ويجب أن يتم إجراء المزيد من الدراسات لتحديد أنواع غير معروفة. وغير PCR القائم على التقنيات الجزيئية الأخرى، مثل مضان في الموقع التهجين (FISH) وميكروأرس الحمض النووي.
في العقدين الأخيرين، وقد اكتسبت أهمية تكنولوجيا متطورة في العديد من مجالات التطبيق، لا سيما في مجال الرصد البيئي. ميكروأرس الحمض النووي تسمح للتمييز بين الأنواع والتحاليل 4، 6، 7 </سوب>، 8، 9، 10، لكنها نظرت الى شاقة للغاية والمهام التي تنطوي على خطوات متعددة (على سبيل المثال، أداء ميكروأري، واستخراج الحمض النووي، PCR التضخيم، والتهجين) تستغرق وقتا طويلا. لهذا السبب، وأقل فحوصات تستغرق وقتا طويلا بناء على الأجسام المضادة، مثل شطيرة وميكروأرس المناعية تنافسية، وأصبحت وسيلة عالية الإنتاجية أساسي وموثوق بها للكشف عن التحاليل البيئية متعددة 11 و 12 و 13. قدرة الأجسام المضادة لتسلم على وجه المركبات المستهدفة وللكشف عن كميات صغيرة من التحاليل والبروتينات، جنبا إلى جنب مع إمكانية إنتاج الأجسام المضادة ضد مادة تقريبا أي، وجعل المجهرية الضد تقنية قوية للأغراض البيئية. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تحقيق متعددة تحلل في مثلإنجل الفحص، مع حدود الكشف بدءا من جزء في البليون إلى PPM، هو واحد من أهم مزايا هذه الطريقة 14.
وقد أثبتت أجهزة الاستشعار القائمة على أجسام مضادة لتكون أدوات حساسة وسريعة للكشف عن مجموعة واسعة من مسببات الأمراض والسموم في الرصد البيئي 15، 16، 17، 18، 19، 20، 21. بينما الأساليب الحمض النووي تنطوي على عدة خطوات، وميكروأرس القائم على الأجسام المضادة لا تتطلب سوى تحضير عينة صغيرة التي تقوم أساسا على خطوة تحلل قصيرة في وجود مخزن مؤقت الحل المناسب. ذكرت Delehanty وLigler 15 كشف في وقت واحد من البروتينات والتحاليل البكتيرية في مخاليط معقدة على أساس المناعي الأجسام المضادة شطيرة قادرة على الكشف عن تركيز البروتين من 4 جزء في البليوند 10 4 كفو / مل من الخلايا. SZKOLA وآخرون. وقد وضعت 21 ميكروأري متعدد رخيصة ويمكن الاعتماد عليه للكشف في وقت واحد proteotoxins والسموم صغيرة، ومركبات التي يمكن استخدامها في الحرب البيولوجية. أنها اكتشفت تركيزات من مادة الريسين السامة، مع الحد من الكشف عن 3 أجزاء من البليون، في أقل من 20 دقيقة. في الآونة الأخيرة، فقد وصفت CYANOCHIP، وهو جهاز الاستشعار البيولوجي استنادا ميكروأري الأجسام المضادة للفي الموقع كشف عن البكتيريا الزرقاء السامة وغير سام، 22. هذا ميكروأري يسمح لتحديد تزهر السيانوبكتيريا المحتملة، ومعظمها في البيئات المائية، التي يصعب تحديد مجهريا. الحد من الكشف عن ميكروأري هو 10 فبراير – 10 مارس خلايا لمعظم الأنواع، وتحول هذا جهاز الاستشعار البيولوجي إلى أداة فعالة من حيث التكلفة للكشف عن تعدد الإرسال وتحديد البكتيريا الزرقاء، حتى على مستوى الأنواع. كل هذه المواصفات تجعل من antiboتقنية ميكروأري دى، وخاصة الطريقة المعروضة في هذا العمل، وهي طريقة أسرع وأبسط مقارنة مع التقنيات المذكورة أعلاه.
يعرض هذا العمل مثالين من التجارب التي تستخدم الأجسام المضادة جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على ميكروأري للكشف عن وجود البكتيريا الزرقاء في عينات من التربة والمياه. وهي طريقة بسيطة وموثوق بها على أساس شكل المناعية شطيرة التي تتطلب كميات عينة صغيرة جدا وإعداد نموذج بسيط للغاية. وتتطلب هذه الطريقة وقت قصير ويمكن أن يؤديها بسهولة في هذا المجال.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، يتم وصف لتعدد الإرسال الفلورسنت شطيرة المناعية باستخدام CYANOCHIP، ميكروأري 17-الأجسام المضادة للكشف والتعرف على مجموعة واسعة من أجناس السيانوبكتيريا، 22. وتمثل هذه البكتيريا الزرقاء أجناس القاعية والعوالق الأكثر شيوعا في موائل المياه العذبة، وبع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكتور أنطونيو كيسادا من جامعة مدريد المستقلة لتوفير سلالات السيانوبكتيريا. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل Subdirección الجنرال دي PROYECTOS دي INVESTIGACION من الإسبان MINISTERIO دي ECONOMIA ذ Competitividad (MINECO)، لا تضمن أي. AYA2011-24803 وESP2014-58494-R.
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
