Experimenteel protocol voor het opsporen<em> Cyanobacteriën</em> In vloeibare en vaste monsters met een antilichaam Microarray Chip
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
Opwarming van de aarde en eutrofiëring maak wat aquatische ecosystemen gedragen als echte bioreactoren die een snelle en massale cyanobacteriën groei leiden; Dit heeft relevante gezondheids- en economische gevolgen. Veel stammen zijn cyanobacterial toxine producenten en slechts weinig cellen nodig om onherstelbare schade aan het milieu veroorzaken. Daarom, water-body overheden en administraties vereisen snelle en efficiënte systemen voor vroegtijdige waarschuwing verstrekken van betrouwbare gegevens om hun preventieve of curatieve beslissingen te ondersteunen. Dit manuscript meldt een experimenteel protocol voor de in het veld detectie van toxine-producerende cyanobacteriën stammen met behulp van een antilichaam microarray chip met 17 antilichamen (ABS) met taxonomische resolutie (CYANOCHIP). Hier, een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) voor de gelijktijdige bewaking van 17 cyanobacteriën stammen vaak gevonden bloeien in zoetwater ecosystemen, sommigen van hen toxine producenten, beschreven. Een microarray met multiple identieke herhalingen (maximaal 24) van de CYANOCHIP werd op een objectglaasje gedrukt gelijktijdig eenzelfde aantal monsters getest. Vloeibare monsters kunnen worden getest, hetzij door directe incubatie met de antilichamen (Abs) of na celconcentratie door filtratie door een 1- tot 3-um filter. Vaste monsters, zoals sedimenten en gemalen rotsen, eerst gehomogeniseerd en gedispergeerd met een handbediende ultrasonicator per incubatiebuffer. Zij worden dan gefilterd (5-20 pm) waardoor het ruwe materiaal te verwijderen en het filtraat wordt geïncubeerd met Abs. Immuunreacties worden onthuld door een uiteindelijke incubatie met een mengsel van de 17 fluorescentie gelabelde Abs en worden gelezen door een draagbare fluorescentiedetector. Het hele proces duurt ongeveer 3 uur, het meeste overeenkomt met twee 1-uur incubatie perioden. De uitvoer is een beeld, waarbij heldere vlekken corresponderen met de positieve detectie van cyanobacteriën markers.
Introduction
De detectie en monitoring van micro-organismen in complexe natuurlijke microbiële gemeenschappen zijn van cruciaal belang op vele gebieden, met inbegrip van medische biologie, ecologie van het milieu, en astrobiology. Cyanobacteriën zijn prokaryotische micro- organismen bekend om hun vermogen om bloemen (excessieve proliferatie) van cellen vormen in zoet water. Ze zijn alomtegenwoordig en vele soorten kunnen toxinen produceren, wat niet alleen een risico betekent voor de gezondheid, maar ook een ecologische impact. In dit verband is het essentieel om snelle en gevoelige methode voor de vroege detectie van cyanobacteriën en / of toxinen in grond en water te ontwikkelen. Voor dit doel is een multiplex fluorescerende sandwich microarray immunoassay (FSMI) is ontwikkeld als instrument voor waterbeheerders om hen te helpen bij het maken van beslissingen en, bijgevolg, bij de uitvoering van de juiste water management programma's.
Een breed scala aan methoden ontwikkeld voor het opsporen en identificeren van cyaanobacterial cellen en cyanotoxines in grond en water, zoals optische microscopie, moleculaire biologie, en immunologische technieken. Deze methoden kunnen sterk variëren in de informatie die zij verstrekken. Microscopische technieken zijn gebaseerd op celmorfologie en de detectie van in vivo fluorescentie van cyanobacteriën pigmenten, zoals phycocyanin of chlorofyl a 1. Hoewel ze zijn snelle en goedkope methoden voor real-time en frequente controle die informeren over de aard en het aantal cyanobacteriën aanwezig is in een monster, hebben ze geen informatie over de mogelijke toxiciteit geven. Bovendien vereisen zij een bepaald niveau van deskundigheid, aangezien het vaak moeilijk om onderscheid te maken tussen nauw verwante soorten 2. Om deze beperkingen te overwinnen, moet lichtmicroscopie worden begeleid door zowel biologische en biochemische screeningstesten en fysisch-chemische methoden voor de identificatie en kwantificatie van cyanotoxines.
<pclass = "jove_content">-enzyme linked immunosorbent assays (ELISA), eiwit fosfaat remmingstesten (PPIA) en neurochemische bij muizen zijn voorbeelden van biochemische screeningsassays voor de detectie van cyanotoxines. Terwijl de eerste twee zijn snelle en gevoelige methoden zijn valse positieven beschreven bij het gebruik van ELISA en PPIA tests worden beperkt tot drie typen gifstoffen. De muis bioassay is een kwalitatieve techniek met een lage gevoeligheid en precisie, en speciale vergunningen en opleiding vereist. Bovendien is het geen informatie over de aard van de giftige stoffen die aanwezig zijn in een monster te geven. Cyanotoxines kunnen worden geïdentificeerd en gekwantificeerd andere analytische werkwijzen, zoals hoge-prestatie vloeistofchromatografie (HPLC), vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS), gaschromatografie (GC), gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), of matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie vluchttijd (MALDI-TOF). Dit is echter alleen mogelijk als referentiestandaarden, die nodiged individuele toxine concentraties in complexe monsters te bepalen, zijn 3, 4. Bovendien zijn deze werkwijzen zijn tijdrovend; vereisen dure apparatuur, voorraden en monster voorbereiding; en moeten worden uitgevoerd door ervaren en gespecialiseerde medewerkers.Moleculair gebaseerde methoden zijn toegepast voor de komende decennia op te sporen, te identificeren en te kwantificeren cyanobacteriën en de bijbehorende cyanotoxines dankzij de sequentie-informatie gepubliceerd in het genoom databases (bv, National Center for Biotechnology Information, NCBI). Onder deze werkwijzen zijn op basis van de polymerasekettingreactie (PCR), waarbij het ontwerp van primersets voor DNA amplificatie vereist en afhankelijk voorkennis van DNA-sequenties van verschillende soorten cyanobacteriën. Terwijl gen detectie, zoals de phycocyanin operon, leidt tot een nauwkeurige identificatie op genus niveau, sommige soorten of stammen zijn onopgemerkt metdeze methode. Echter, toxine-coderende genen, bijvoorbeeld die welke behoren tot de microcystine operon, vergemakkelijken de identificatie van toxines in monsters waar de producenten schaars 5. Niettemin heeft de detectie van toxine markers door PCR niet noodzakelijkerwijs toxiciteit in het milieu. Bovendien is de set van primers ontwikkeld om het hele scala van soorten cyanobacteriën en toxine producenten aanwezig zijn in een monster te analyseren is nog onvolledig, en verder onderzoek moet worden gedaan om onbekende soorten te identificeren. Andere moleculaire technieken niet PCR-gebaseerde, zoals fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) en DNA microarrays.
In de laatste twee decennia heeft microarray technologie aan belang gewonnen op vele toepassingsgebieden, met name in het milieu monitoring. DNA microarrays mogelijk maken onderscheid tussen soorten en analyten 4, 6, 7 </sup>, 8, 9, 10, maar ze worden beschouwd als zeer omslachtig en tijdrovend taken die meerdere stappen (bijvoorbeeld microarray prestaties, DNA extractie, PCR amplificatie en hybridisatie) omvatten. Daarom minder tijdrovend assays op basis van antilichamen, zoals sandwich en competitieve immunologische microarrays, een essentieel en betrouwbare high-throughput werkwijze voor de detectie van meerdere analyten milieu 11, 12, 13 worden. Het vermogen van antilichamen om specifiek herkennen de doelverbindingen en kleine hoeveelheden analyten en eiwitten te detecteren, samen met de mogelijkheid van het produceren van antilichamen tegen vrijwel alle stoffen, maak antilichaam microarrays een techniek om milieuredenen. Bovendien is de mogelijkheid van het bereiken meerdere analyses alsingle assay, met detectiegrenzen variërend van ppb tot ppm, is een van de belangrijkste voordelen van deze methode 14.
Antilichamen gebaseerde biosensoren bleken gevoelige en snelle instrumenten voor de detectie van een breed scala van pathogenen en toxinen in milieucontrole 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 zijn. Terwijl DNA werkwijzen omvatten verschillende stappen, het op antilichaam gebaseerde microarrays vereisen slechts een kleine steekproef preparaat dat hoofdzakelijk gebaseerd is op een korte lysisstap in een geschikte buffer oplossing. Delehanty en 15 League Meeste meldde de gelijktijdige detectie van eiwitten en bacteriële analyten in complexe mengsels van een antilichaam sandwich immunoassay voor het opsporen van een eiwitconcentratie van een 4 ppbd 10 4 cfu / ml cellen. Szkola et al. 21 is een voordelige en betrouwbare multiplex microarray voor de simultane detectie van proteotoxins en kleine toxines verbindingen die kunnen worden gebruikt als biologisch wapen ontwikkeld. Het gedetecteerde concentraties ricine toxine, met een detectiegrens van 3 ppb, in minder dan 20 minuten. Onlangs heeft de CYANOCHIP een antilichaam microarray-gebaseerde biosensor voor de in situ detectie van toxische en toxische cyanobacteriën beschreven 22. Dit microarray maakt de identificatie van potentiële cyanobacteriënbloeien, meestal in waterige omgevingen die moeilijk microscopisch identificeren. De detectiegrens van de microarray is 10 februari – 10 maart cellen voor de meeste soorten, het draaien van deze biosensor in een kosteneffectief instrument voor de multiplex detectie en identificatie van cyanobacteriën, zelfs op het niveau van soorten. Al deze eigenschappen maken de AntiboDY microarray techniek, met name de methode die in dit werk, sneller en eenvoudiger methode dan de bovengenoemde technieken.
Dit werk toont twee voorbeelden van experimenten die een antilichaam microarray gebaseerde biosensor om de aanwezigheid van cyanobacteriën in bodem- en watermonsters te detecteren. Het is een eenvoudige en betrouwbare methode gebaseerd op een immunoassay format dat zeer kleine monsterhoeveelheden en zeer eenvoudige monstervoorbereiding vereist. De werkwijze vereist een korte tijd en kan gemakkelijk worden uitgevoerd in het veld.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wordt een multiplex fluorescerende sandwich immunoassay met de CYANOCHIP, een 17-antilichaam microarray voor de detectie en identificatie van een breed scala van cyanobacteriën genera, beschreven 22. Deze blauwalgen vormen de meest voorkomende bodemdieren en plankton genera in zoetwaterhabitats, sommigen van hen zijn toxine producenten. Onlangs heeft de fluorescentie immunoassay format gebruikt om micro-organismen en / of bioanalytes identificeren milieutoepassingen <sup class="xre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. Antonio Quesada aan de Universidad Autónoma de Madrid voor het verstrekken van cyanobacteriën stammen. Dit werk werd gefinancierd door de Subdirección General de Proyectos de Investigación van de Spaanse Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), verleent geen. AYA2011-24803 en ESP2014-58494-R.
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
