Il trapianto di isole nel supporto del grasso epididimico dei topi diabetici
Summary
Questo protocollo dimostra l'isolamento delle isole murine e la semina su un impalcatura decellulare. Isole supportate da ponteggi sono state trapiantate nel pad di grasso epididimo di topi diabetici indotti da streptozotocina (STZ). Isole sopravvissute al sito di trapianto e invertite la condizione iperglicemica.
Abstract
Il trapianto delle isole è stato clinicamente dimostrato efficace nel trattamento del diabete di tipo 1. Tuttavia, l'attuale strategia intraepatica di trapianto può comportare reazioni sanguigne intere acute e provocare un cattivo ingrasso di isole. Qui riportiamo un robusto protocollo per il trapianto di isole nel sito di trapianto extraepatico, il pad di grasso epididimo (EFP), in un modello di topi diabetici. Viene descritto un protocollo per isolare e purificare isole a rendimenti elevati da topi C57BL / 6J, nonché un metodo di trapianto eseguito da isole isolanti su un basamento decellulato (DCS) e implantarli sul sito EFP in topi sintesi C57BL / 6J resi diabetici Da streptozotocina. L'innesto DCS contenente 500 isole ha invertito la condizione iperglicemica entro 10 giorni, mentre gli isolotti liberi senza DCS hanno richiesto almeno 30 giorni. La normoglicemia è stata mantenuta fino a 3 mesi fino a quando l'innesto è stato esplorato. In conclusione, DCS ha potenziato l'inserimento di isole in tIl sito extraepatico dell'EFP, che potrebbe essere facilmente recuperato e potrebbe fornire una piattaforma riproducibile e utile per indagare i materiali dello scaffold, così come altri parametri di trapianto necessari per un successo nell'inserimento delle isole.
Introduction
Il diabete mellito di tipo 1 (T1D) è un disturbo endocrino autoimmune in cui le cellule delle isole vengono ablate dal sistema immunitario, rendendo i pazienti dipendenti dall'iniezione di insulina esogena per tutta la vita. Il protocollo di Edmonton rappresenta una pietra miliare negli studi clinici del trapianto di isole; Isole sono state infuse attraverso la vena portale e trapiantate nel sito intraepatico 1 . Tuttavia, due principali ostacoli, inadeguate fonti di isole donatrici e una scarsa assunzione di isole, impediscono l'ampio successo del trapianto di isole 2 . Di solito, isolotti devono essere raccolti da tre donatori cadaverici per invertire la condizione iperglicemica di un paziente; Ciò è dovuto alla bassa resa delle procedure di isolamento delle isole e alla perdita di isole dopo il trapianto. In particolare, sebbene gli isolotti post-trapiantati venissero bagnati in sangue ricco di ossigeno, il contatto diretto con il sangue evocava spesso l'inflamma istantanea mediata dal sangue(IBMIR), che potrebbe causare la perdita acuta delle isole. A lungo termine, si pensa che la graduale perdita di isolotti nei pazienti rappresentasse la diminuzione dei tassi di inversione del diabete nei gruppi clinici, che potrebbero raggiungere il 90% nel primo anno e scendere al 30% e al 10% per 2 e 5 Anni post-trapianto, rispettivamente 3 .
Il trapianto delle isole nei siti extraepatici è stata una strategia attraente per ridurre il contatto diretto delle isole con il sangue e confinare i trapianti in posizioni più definibili rispetto all'infezione intraepatica. Gli studi sono stati condotti negli anni passati nella capsula, nell'occhio, nel muscolo, nei grassi e negli spazi sottocutanei, mostrando che le isole in questi siti sono in grado di sopravvivere e di funzionare per ripristinare la normoglicemia 4 . Inoltre, le isole in questi siti sono recuperabili, rendendo possibile la biopsia o persino per ulteriori procedure di sostituzione. Extrahepatic sPertanto dimostrano un grande potenziale per il trapianto clinico 5 .
Gli scaffold basati su biomateria sono stati studiati intensamente per il trapianto di cellule e l'ingegneria dei tessuti. Gli scaffoldi tridimensionali (3D) di solito contengono strutture porose e possono servire come modelli cellulari per generare struttura spaziale / organizzazione di cellule o come serbatoi per fornire il rilascio controllato di segnali bioattivi. I ponteggi sono stati inoltre fabbricati in materiali polimerici come poli (glicolide-L-lattido) 6 , poli (dimetilsilossano) 7 e poli (uretano) termoplastico 8 , a isole di trapianto nell'EFP. Rispetto al trapianto diretto delle isole, è stato riscontrato l'utilizzo di scaffold per ridurre la perdita di isole, prevenendo la perdita di isole nella cavità intraperitoneale 9 , 10 , fornendo protezione meccanica e moduLa reazione infiammatoria locale. Gli scaffold possono pertanto essere sviluppati per promuovere l'assunzione di isole nei siti di trapianto 7 .
In questo studio intendiamo dimostrare un paradigma del trapianto di isole nell'EFP, eseguito nei modelli di topi usando un DCS. Gli scaffali derivati da matrici extracellulari hanno attirato grande interesse negli ultimi anni a causa della biocompatibilità superiore e delle strutture porose più naturali rispetto ai prodotti sintetici. Qui descriviamo un robusto protocollo di isolamento per ottenere isole pancreatiche a rese elevate da topi C57BL / 6J. I DCS elaborati dal pericardio bovino sono stati poi seminati con isole e gli innesti sono stati trapiantati nell'EFP nei modelli diabetici singenici. La normoglicemia nei topi è stata raggiunta entro 10 giorni ed è stata mantenuta fino a 100 giorni, fino alla rimozione degli innesti.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perfusione del pancreas e il tempo di digestione sono due parametri chiave che influenzano la resa e la qualità delle isole. Moskalewski ha segnalato per la prima volta l'uso di una miscela di collagenasi grezzo per la digestione del pancreas di guinea pig macinato 11 . Lacy et al. Ha segnalato l'iniezione di enzimi nel sistema del condotto per perfezionare il pancreas, che ha notevolmente aumentato il rendimento delle isole 12 . La perfusione duttale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrebbero ringraziare Wei Zhang da Guanhao Biotech per fornire gli scaffali decellulari. Ringraziamo Xiao-hong Peng per le discussioni utili. Questa ricerca è stata sostenuta finanziariamente dalla National Science Foundation della Cina (progetto n.31322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
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