ייחסתי<em> Gambiae אנופלס</em> יתושים עם חרוזים כדי לעודד ו למדוד את התגובה החיסונית melanization

Summary

Through inoculation with beads, the described technique enables the stimulation of the mosquito melanization response in the hemolymph circulating system. The amount of melanin covering the beads can be measured after dissection as a measure of the immune response.

Abstract

הגירוי של המערכת החיסונית הוא כלי נפוץ מחקרים חסרי חוליות לבחון את היעילות ואת מנגנוני חסינות. גירוי זה מבוסס על הזרקת חלקיקים שאינם פתוגניים לתוך חרקים, שכן חלקיקי יזוהו על ידי המערכת החיסונית יניעו את הייצור של effectors החיסונית. אנו מתמקדים כאן על גירוי של התגובה melanization של היתוש אנופלס gambiae. התוצאות בתגובה melanization ב אנקפסולציה של חלקיקים זרים וטפילים בשכבה כהה של מלנין. כדי לעורר את התגובה הזאת, יתושים הם מחוסנים עם חרוזים את חלל בית החזה באמצעות צינורות זכוכית microcapillary. ואז, לאחר 24 שעות, היתושים הם גזורים כדי לאחזר את החרוזים. מידת melanization של החרוז נמדדת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. חרוזים לא צריכים את ההשפעות פתוגניים של טפילים, או יכולתי להתחמק או לדכא את התגובה החיסונית. זריקות אלו הן דרך צפחותמחדש יעילות חיסון ואת ההשפעה של גירויים חיסוניים על תכונות היסטורית חיים אחרות, כגון פוריות או אריכות ימים. זה לא בדיוק אותו דבר כמו ללמוד ישירות אינטראקציות המארח טפיל, אבל זה כלי מעניין ללמוד חסינות אקולוגיה אבולוציונית שלה.

Introduction

חרקים להסתמך על המערכת החיסונית כדי להגן על עצמם מפני טפילים ופתוגנים ^{1 – 3} המפרות דרך לציפורן שלהם או midgut שלהם האפיתל ^4. בשנת יתושים, התגובות הללו הם יעילים כנגד חיידקים ^5, וירוסים ^6, נמטודות filarial ^7, ו טפילי מלריה ^1,8,9. בשנת יתושים, תגובה חיסונית מפתח היא אנקפסולציה של חלקיקים זרים עם מלנין ^{10 – 12.} אנקפסולציה זה עשוי לקרות midgut או ב hemolymph במחזור מערכת ^{10 – 12.} בתגובה melanization זוהי תוצאה של-phenoloxidase פרו מפל ^{10 – 12,} וזה יכול לגרום למוות של טפילים או phagocytosis שלהם. בשנת יתושים בוגרים, שבו מספר תאי hemocytes מוגבל, melanization היא תגובת לחות, כמו נגד טפילי Plasmodium או נמטודות filarial ^7.בחלק וחרקים אחרים, זה ישירות התאים hemocytes כי להתאסף סביב הטפיל כדי melanize אותם ^7. חוץ מזה, מלנין חיוני גם כמה תהליך פיסיולוגי אחר כמו ייצור ביצים ופצעים לציפורן ריפוי ^7.

הגירוי של מערכת חיסונית משמש ככלי ללמוד חסינויות חרקים בכמה מערכות מודל בריאות חקלאית וציבורי ^{13 – 18.} הוא משמש אנופלס יתושי gambiae, הווקטור הגדול של במלריה באפריקה, כדי לחקור אינטראקציות מארח טפיל ^{14 – 16,19.} טכניקות אלו מבוססות על הקיבולת של חרקים כדי לזהות טפילים עם קולטנים זיהוי דפוסים שלהם (PRR) ^2. יתושים יכולים גם לזהות מולקולות אחרות מפריעות הביולוגיה שלהם כגון דפוסים מולקולריים הקשורים הפתוגן (PAMPs), או לזהות תאים הפגומים שלהם עקב השחרור של קולגן וחומצות גרעין. תא היתושים החיסוניים כגון hemocytes משמש לגילוי ^{20 – 23.} מסלולי האיתות החיסוניים העיקריים הם IMD, אגרה, JAK / STAT ^24, והפרעת חומצה ריבונוקלאית (RNAi) ^25,26. שניהם אגרה ושבילי IMD להשפיע על תגובת melanization ולתקשר עם-phenoloxidase פרו מפל ^{10 – 12.}

הכלי הסטנדרטי המשמש לעורר את תגובת melanization הוא החיסון של יתוש עם חרוז קטן לתוך hemolymph של חלל בית החזה. מידת אנקפסולציה מלנין לאחר מכן ניתן למדוד ¹⁹ לאחר אחזור חרוז באמצעות דיסקציה של היתוש. במרבית המחקרים, רק חרוז אחד שהוזרק לכל יתוש ^15,16,27, אך הזרקת חרוזים יותר אפשרי על מנת ללמוד את גבולות התגובה melanization ^19. חרוזים אלה מוזרקים באמצעות פתרון הזרקה (בסרום פיסיולוגי) להגביל הפרעה של פיזיולוגית היתושיםההתייבשות של היתוש ^15,16,27. לצבוע מתווסף פתרון זה כדי להקל מבחר חרוז. זה אותו הדבר עבור הפתרון לנתיחה בשימוש כדי לאחזר את ^15,16,27 חרוז.

היתרון של יחסינו חרקים עם גירויים שאינם פתוגניים הוא היכולת להתמקד ההשפעה הישירה על התגובה החיסונית. אין תופעות סיבוך עקב פתוגניות טפילה ^28, דיכוי חיסוני ^{29 – 31,} או התחמקות חיסון ^{31 – 34.} חוץ מזה, את ההשלכות של הגירויים על תכונות היסטורית חיים אחרות, כגון תוחלת חיים או פוריות, יכולות להיות גם למדו. לפיכך, חוקרים לומדים אקולוגיה אבולוציונית עשויים לדרוש כלים כגון ^2,35,36. לדוגמא, דבורי מאותגרים חיסוניים יש תוחלת חיים מקוצרת תחת רעב. דומות השפעות שליליות של גירויים ופריסות חיסוניים נצפו דגמים חסרי חוליות שונים, ופעמים רבות תוצאה הוא קצראה תוחלת חיים או פחות רביית הצלחה ^13,27,37. ניתן לבצע מחקרים כאלה בסביבות משתנות ^2,4,38. גירוי החסינות היא גם לעניין את אלו מתמקדים ישירות על immunopathology ^39,40.

פרוטוקול זה מבוסס על החיסון של חרוזים עם יתושים כדי לעורר את תגובת melanization וישירות למדוד את כמות המלנין. זה מאפשר מחקר כמותי ואיכותי של התגובה melanization במסגרות ניסיוניות שונות. כלי כזה יכול להתארך עד הגירוי של תגובות חיסוניות אחרות, כגון תגובה אנטיבקטריאלי לחום-הרג חיידקים ^41. זה גם יכול להתנהל במסגרות אקולוגית רבה.

Protocol

1. תמיסת מלח עבור הזרקת Dissection הכן את תמיסת מלח על ידי הוספת NaCl, KCl, ו CaCl 2 למים מזוקקים כדי להשיג 1.3 מ"מ NaCl, KCl 0.5 מ"מ ו -0.2 מ"מ CaCl 2 ב- pH = 6.8. הוסף 1 מ"ל של פתרון ירוק מתיל 0.1% ל -99 מיל…

Representative Results

יתושים לא כל melanize חרוזים באותה דרך, כמו כמה חרוזים היו פחות מכוסה המלנין יותר מאחרים (איור 1). ואכן, כמה חרוזים נשאר כחולים בגלל חוסר melanization, בעוד שאחרים היו חושך מוחלט (איור 1). השווי melanization היה טופל על ידי אינטרפולציה ליניארית לער…

Discussion

טכניקת ההזרקה זו שימושית כדי לעורר וללמוד את התגובה melanization יתושים. לדוגמא, כאן אנו בחנו את ההשפעה של עומס הגירויים החיסוני.

השלב הקריטי בהליך זה הוא לחסן היתוש כראוי. כל נזק מוגזם לשרירים הטיסה או היתוש עצמו עשוי למנוע את היתושים ?…

Materials

Microcapillary glass tubes GB120TF-10	science-products.com	GB120TF-10	http://www.science-products.com/Products/CatalogG/Glass/Glass.html
Microcaps Capillary pipette bulb	Drumond	1-000-9000
negatively charged Sephadex CM C-25 beads	Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany	C25120 SIGMA	need few to start
Methyl green	Sigma-Aldrich	323829 ALDRICH	need few to start
Software ImageJ	opensource		Version 1.47f7 or later