Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Kromatin immunofældning (chip) er et uundværligt redskab inden for epigenetik og genregulering, der isolerer specifikke protein-DNA interaktioner. Chip koblet til high throughput sekventering (chip-seq) er almindeligt anvendt til at bestemme den genomiske placering af proteiner, der interagerer med kromatin. Imidlertid er chip-seq hæmmet af forholdsvis lav kortlægning opløsning på flere hundrede basepar og høj baggrundssignal. Chippen-exo-metoden er en raffineret udgave af chip-seq, der væsentligt forbedrer både opløsning og støj. Det centrale skelnen af chip-exo metode er inkorporeringen af lambda exonucleasefordøjelse i biblioteket forberedelse workflow til effektivt fodaftryk venstre og højre 5'DNA-grænser af proteinet-DNA krydsbinding site. Chippen-exo biblioteker underkastes derefter high throughput sekventering. De resulterende data kan udnyttes til at give unikke og ultra-høj indsigt opløsning til den funktionelle organisation of genomet. Her beskriver vi chippen-exo-metoden, som vi har optimeret og strømlinet for mammale systemer og næste generation sekventering-by-syntese platform.
Chromatin immunoprecipitation (chip) er en kraftfuld metode til at studere mekanismer genregulering ved selektivt at berige for DNA-fragmenter, der interagerer med et givet protein i levende celler. Fremgangsmåder til chip-beriget DNA-fragmenter Detection har udviklet sig som teknologien forbedres, fra detektering af et enkelt locus (standard chip-qPCR) til hybridisering på oligonucleotid-mikroarrays (chip-chip) til high-throughput sekventering (chip-seq) 1. Selvom chip-seq har set udbredt anvendelse, kromatin heterogenitet og uspecifikke DNA interaktioner er hæmmet datakvalitet, der fører til falsk positive og upræcis kortlægning. For at omgå disse begrænsninger, Dr. Frank Pugh udviklet chip-exo metode 2. Den iøjnefaldende træk ved chip-exo er, at de indeholder et 5 'til 3' exonuklease, effektivt footprinting transkriptionsfaktor bindende steder. Som følge heraf chippen-exo metode opnår højere opløsning, større dynamikområde detection, og lavere baggrundsstøj.
Selvom chip-exo er mere teknisk udfordrende at mestre end chip-seq, er det i vid udstrækning vedtaget som undersøgelser har til formål at få unikke ultra indsigt høj opløsning ved hjælp af forskellige biologiske systemer 3-8. Faktisk har chip-exo med held været anvendt til bakterier, gær, mus, rotte, og humane cellekulturer. Som bevis på princippet blev chip-exo oprindeligt brugt til at identificere den præcise bindende motiv for en håndfuld af gær transskription faktorer 2. Teknikken blev også anvendt i gær til at undersøge organiseringen af transkription pre-initieringskompleks, og at dechifrere subnucleosomal struktur af forskellige histoner 9,10. For nylig vi gearede chip-exo at løse tilstødende TFIIB og Pol II bindende begivenheder på humane promotorer, og viste, at udbredt divergent transkription skyldes distinkt initieringskomplekser 11.
Arbejdsgangen præsenteres her er optimeret og streamlined For mammale chip-exo (figur 1). Først lever primære eller vævskulturceller behandlet med formaldehyd for at bevare in vivo protein-DNA-interaktioner gennem en kovalent tværbinding. Cellerne lyseres og chromatin sheared til ~ 100 – 500 basepar størrelse fragmenter. Chip derefter selektivt beriger for DNA-fragmenter tværbundet til proteinet af interesse. På dette tidspunkt er chip-seq biblioteker fremstilles typisk, som i sagens natur begrænser påvisning beslutning til gennemsnitlige fragment størrelse på nogle få hundrede basepar. Imidlertid chip-exo overvinder denne begrænsning ved at trimme den venstre og højre 5 'DNA-grænserne af proteinet-DNA krydsbinding site med lambda exonuklease. Sekventeringsreaktioner biblioteker konstrueres derefter fra exonuklease fordøjet DNA som beskrevet nedenfor. De resulterende indlejrede 5'grænser udgør en in vivo fodaftryk af proteinet-DNA interaktion (figur 1, trin 14), og detekteres af high throughput sekventering. altHough chip-exo metode er mere involveret end chip-seq, overgange mellem de fleste trin kræver enkel perle vask, hvilket minimerer prøvetab og eksperimentel variabilitet. Vigtigere er det, da chip-exo er en raffineret udgave af chip-seq, enhver prøve, som er vellykket med chip-seq bør også være en succes med chip-exo.
In vivo footprinting af protein-DNA-interaktioner med chip-exo resulterer i en grundlæggende forskellige datastruktur fra chip-seq. Selvom almindelige Chip-seq opkaldere kan anvendes på chip-exo-data, for at opnå de mest præcise peak opkald anbefaler vi bioinformatiske værktøjer specifikt designet med den unikke struktur i chip-exo-data i tankerne. Disse omfatter Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla, og ExoProfiler 12-15.
Vi præsenterer en funktionel genomisk protokol til at bestemme den præcise bindende sted for kromatin interagerende proteiner i en fordomsfri, genom-dækkende måde ved nær basepar opløsning. Det mest kritiske trin for at opnå nær basepar kortlægningsopløsning er exonukleasebehandling af chip-beriget DNA mens immunopræcipitatet forbliver på magnetiske harpiks. Tilsyneladende kunne proteinkomplekser potentielt blokere in vivo footprinting af enhver given underenhed (fx chromatin remodeli…
The authors have nothing to disclose.
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |