O Método ChIP-exo: Identificando Protein-DNA Interações com perto da base Pair Precision
Summary
Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.
Abstract
imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é uma ferramenta indispensável nos campos da epigenética e regulação de genes que isola as interações proteína-ADN específicos. ChIP acoplado a sequenciação de alto rendimento (ChIP-SEQ) é normalmente usado para determinar a localização genómica de proteínas que interagem com a cromatina. No entanto, ChIP-seq é dificultada pela resolução relativamente baixa de mapeamento de várias centenas de pares de bases e alto sinal de fundo. O método ChIP-exo é uma versão refinada do ChIP-seq que melhora substancialmente com a ambas resolução e ruído. A distinção fundamental da metodologia de ChIP-exo é a incorporação de digestão com exonuclease lambda no fluxo de trabalho para a preparação da biblioteca pegada de forma eficaz a esquerda e para a direita 5 fronteiras de ADN do local de ligação cruzada do ADN-proteína. As bibliotecas Chip-exo são então sujeitas a sequenciação de alto rendimento. Os dados resultantes podem ser aproveitados para proporcionar uma visão única e ultra-alta resolução para a organização funcional of do genoma. Aqui, descrevemos o método ChIP-exo que temos otimizado e simplificado para os sistemas de mamíferos e uma plataforma de sequenciamento-by-síntese da próxima geração.
Introduction
imunoprecipitação da cromatina (ChIP) é um método poderoso para estudar os mecanismos de regulação de genes por enriquecer selectivamente para fragmentos de ADN que interagem com uma dada proteína em células vivas. Métodos de detecção de fragmentos de DNA enriquecido-chip evoluíram como a tecnologia melhora, desde a detecção de um único locus (standard ChIP-qPCR) para hibridação em microarranjos de oligonucleotídeos (Chip-chip) para sequenciamento de alto rendimento (ChIP-seq) 1. Embora ChIP-seq tem visto aplicação generalizada, a heterogeneidade da cromatina e interações de DNA não específicos têm dificultado a qualidade dos dados levando a falsos positivos e mapeamento impreciso. Para contornar essas limitações, o Dr. Frank Pugh desenvolveu o método ChIP-exo 2. A característica saliente do chip de exo-é que incorpora uma 5 'a 3' exonuclease de forma eficaz footprinting factor de transcrição locais de ligação. Como resultado, a metodologia ChIP-exo atinge mais de alta resolução, uma gama dinâmica maior de detection, e menor ruído de fundo.
Embora ChIP-exo é tecnicamente mais difícil de dominar do que ChIP-seq, ele está sendo amplamente adotado como estudos como objectivo obter uma visão única de altíssima resolução usando diversos sistemas biológicos 3-8. Na verdade, Chip-exo foi aplicado com sucesso em bactérias, leveduras, rato, rato, e sistemas de células humanas. Como prova de princípio, Chip-exo foi originalmente usado para identificar o motivo de ligação preciso para um punhado de transcrição de levedura fatores 2. A técnica também foi usada em levedura para o estudo da organização do complexo de pré-iniciação da transcrição, e para decifrar a estrutura de vários subnucleosomal histonas 9,10. Mais recentemente, temos alavancado ChIP-exo para resolver TFIIB adjacente e Pol II eventos em promotores humanos vinculativo, e mostrou que a transcrição divergente generalizada surge de iniciação distintos complexos 11.
O fluxo de trabalho aqui apresentado é otimizado e streamlined para Chip-exo de mamífero (Figura 1). Em primeiro lugar, que vivem células de cultura primárias ou tecidos são tratados com formol para preservar em interações proteína-ADN in vivo através de uma ligação cruzada covalente. As células são lisadas e cromatina tosquiada de ~ 100 – 500 fragmentos de tamanho de pares de bases. ChIP então enriquece selectivamente fragmentos de ADN para reticulados para a proteína de interesse. Neste ponto, as bibliotecas de chip SEQ são tipicamente preparados, o que limita inerentemente a resolução de detecção para o fragmento de tamanho médio de algumas centenas de pares de bases. No entanto, Chip-exo supera esta limitação aparando o direito 5 fronteiras de ADN do local de ligações cruzadas proteína-DNA com exonuclease lambda e esquerdo. bibliotecas de sequenciação são então construído a partir de ADN digerido com exonuclease como detalhado abaixo. As fronteiras aninhados 5 'resultantes representam uma pegada in vivo da interacção ADN-proteína (Figura 1, o passo 14), e são detectados por sequenciação de elevado rendimento. AltHough a metodologia ChIP-exo é mais envolvido do que ChIP-seq, transições entre a maioria das etapas requer lavagem cordão simples, que minimiza a perda de amostra e da variabilidade experimental. Importante, uma vez que ChIP-exo é uma versão refinada do ChIP-seq, qualquer amostra que seja bem sucedido com o chip-seq também deve ser bem sucedido com o chip-exo.
O footprinting in vivo de interacções proteína-ADN com resultados ChIP-exo numa estrutura de dados fundamentalmente distinto ChIP-seq. Embora chamadores comuns Chip-seq pode ser aplicada a dados do chip-exo, para obter as chamadas pico mais precisos recomendamos ferramentas de bioinformática projetados especificamente com a estrutura única de dados do chip-exo em mente. Estes incluem Genetrack, GEM, MACE, Peakzilla e ExoProfiler 12-15.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nós apresentamos um protocolo de genômica funcional para determinar a localização de ligação preciso para cromatina proteínas que interagem de uma maneira imparcial, genome-wide em perto de resolução de pares de bases. O passo mais crítico para alcançar perto da base uma resolução de mapeamento par é o tratamento exonuclease do DNA enriquecido com chip, enquanto o immunoprecipitate permanece na resina magnética. Aparentemente, complexos de proteína poderia bloquear footprinting in vivo de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the Venters Lab and members of the Molecular Physiology and Biophysics Department for helpful discussions. Special thanks to Frank Pugh for his guidance, mentoring, and many insightful discussions on the nuances of ChIP-exo while I was a post-doctoral fellow in his laboratory.
Materials
| 37% formaldehyde, methanol free, 10x10ml ampules | ThermoFisher Scientific | 28908 | Section 3 |
| Complete Protease Inhibitor cocktail (CPI) | Roche Life Science | 11873580001 | Sections 4, 8 |
| Bioruptor sonicator | Diagenode | UCD200 | Section 5 |
| 15 ml polystyrene tubes | BD Falcon | 352095 | Section 5 |
| MagSepharose Protein G Xtra beads | GE Healthcare | 28-9670-66 | Section 6 |
| DynaMag-1.5ml Side Magnetic Rack | Invitrogen | 12321D | Sections 6-17, 22 |
| Mini-Tube Rotator | Fisher Scientific | 05-450-127 | Sections 7, 22 |
| T4 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0203 | Section 9 |
| DNA Polymerase I, Klenow | New England BioLabs | M0210 | Section 9 |
| 10x NEBuffer 2 (10x Reaction Buffer 2) | New England BioLabs | B7002 | Sections 9-11, 13, 15, 20 |
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382 | Sections 9-16 |
| ATP | Roche Life Science | 010419979001 | Sections 9, 11, 13 |
| dNTPs | New England BioLabs | N0447 | Sections 9, 12, 19, 23 |
| T4 Polynucleotide Kinase | New England BioLabs | M0201 | Sections 9, 13 |
| dATP | New England BioLabs | N0440 | Sections 10, 20 |
| Klenow 3'-5' Exo Minus | New England BioLabs | M0212 | Sections 10, 20 |
| T4 DNA ligase | New England BioLabs | M0202 | Sections 11, 21 |
| Φ-29 DNA Polymerase | New England BioLabs | M0269 | Sections 12, 19 |
| 10x Φ-29 Buffer | New England BioLabs | B0269 | Sections 12, 19 |
| Lambda Exonuclease | New England BioLabs | M0262 | Section 14 |
| 10x Lambda Buffer | New England BioLabs | B0262 | Section 14 |
| RecJf Exonuclease | New England BioLabs | M0264 | Section 15 |
| Proteinase K | Roche Life Science | 03115828001 | Section 16 |
| Glycogen | Roche Life Science | 010901393001 | Section 18 |
| 10x T4 Ligase Buffer | New England BioLabs | B0202 | Section 21 |
| AMPure XP (clean up) beads | Beckman Coulter | A63881 | Section 22 |
| Q5 Hot Start DNA Polymerase | New England BioLabs | M0493 | Section 23 |
| 5x Q5 Buffer (5x PCR Buffer) | New England BioLabs | B9027 | Section 23 |
| Qubit Fluorometer | Invitrogen | Q33216 | Section 25 |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | Section 25 |
| Optical Clear Qubit tubes | Invitrogen | Q32856 | Section 26 |
| Qubit dsDNA High Sensitivity Assay kit | Invitrogen | Q32851 | Section 26 |
References
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