El alimentador de ensayo capilar para analizar el consumo de alimentos en<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.
Abstract
For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.
Introduction
Comer es esencial; Sin embargo, la desregulación de la ingesta de alimentos que resulta en trastornos de la alimentación como la bulimia, la anorexia o la tendencia general a comer en exceso supone un coste para la sociedad y los individuos 1, 2, 3. El objetivo de la presente investigación es descubrir los mecanismos de regulación de la ingesta de alimentos y para proporcionar una estrategia para eludir la formación trastorno. Numerosos estudios utilizando organismos modelo de mamíferos han proporcionado nuevos conocimientos de los circuitos y el papel de los sistemas de señalización en los trastornos de 4, 5, 6 de comer. Sin embargo, nuestro conocimiento de las bases neuronales y moleculares que subyacen a estos trastornos se mantiene lejos de ser completa. En los últimos años, la mosca de la fruta Drosophila melanogaster se ha convertido en un sistema modelo valioso para desentrañar conocimientos mecánicos básicos en la regulación de metabolism 7, 8, 9. El ensayo capilar de alimentación (CAFE) de Drosophila melanogaster se estableció en el laboratorio de Seymour Benzer en 2007 inspirado en un trabajo anterior de Dethier en blowfly 10, 11. El ensayo CAFE hizo posible medir directamente la ingesta de alimentos en Drosophila melanogaster. En este sistema de análisis de comportamiento, las moscas se alimentan de alimento líquido proporcionado en capilares de vidrio graduadas colocadas dentro de un vial. El descenso del menisco capilar indica pérdida de solución de alimentación a través de la evaporación y consumo de alimentos. La determinación de la velocidad de evaporación por viales sin moscas permite la cuantificación precisa de la ingesta de alimentos.
El ensayo Café es uno de los diversos paradigmas de comportamiento utilizados para medir la alimentación en Drosophila melanogaster y los investigadores tienen que elegir el más adecuado para su específicapregunta. La decisión de utilizar un determinado ensayo deben considerar los siguientes puntos: la naturaleza de los alimentos proporcionados; la condición de alimentación; la medición de la ingesta o absorción de nutrientes y el consumo de alimentos investigación o de reacción a la alimentación.
El ensayo CAFE como se describe en este informe es ideal para después de la ingesta de alimentos de una fuente de alimento líquido bajo una condición de la alimentación en posición vertical. Como alternativa, la ingesta de alimentos se puede medir para un grupo mosca en una fuente de alimento de color en un vial o en una placa. Las moscas se mataron normalmente o anestesiados después de la alimentación y la cantidad de colorante ingerido se determina por espectrometría o inspección visual del abdomen manchado. Las moscas comienzan a excretar los alimentos ingeridos solamente 30 min después de la ingesta, por lo tanto, este enfoque es difícil de utilizar para el análisis de la alimentación ya continua comportamientos 12, 13.
En contraste moscas se mantienen intactos cuando colorante absorbibles con trazadores radioactivos se utilizan y su consumo de radioisótopo se anotó en un contador de centelleo de 14, 15. La absorción del radiofármaco por el sistema digestivo de la mosca hace posible la medición de la absorción de alimentos a largo plazo, pero podría llevar a una subestimación del consumo a causa de las moléculas no absorbidos y excretados trazadores. Otro enfoque para medir la respuesta a la alimentación en Drosophila melanogaster es la respuesta extensión proboscis (PER), que normalmente se produce por la ingesta de alimentos 16. Este método elegante mide la respuesta inicial a un estímulo comida, pero no registra la cantidad de ingesta. La ingesta de alimentos se ajusta dinámicamente durante la alimentación utilizando varias señales de retroalimentación post-digestivas que son críticos para la regulación de la alimentación 17, 18. Varios intentos se han hecho en los últimos años para la recolección de datos semi-automatizar en el ensayo PER <shasta class = "xref"> 19, 20. El PER es detectado por una almohadilla eléctrica o una combinación de electrodos y contó a través del ordenador. Combinando el ensayo PER con la absorción de radioisótopos reveló que este ensayo está limitado por la baja sensibilidad a la detección de diferencias de alimentación cantidad 18. El ensayo manual de alimentación (MAFE) 21, en el que una mosca se alimenta manualmente con un capilar de vidrio, se ha desarrollado recientemente para determinar el consumo de alimento en una sola mosca inmovilizado. El ensayo MAFE elimina las interferencias de búsqueda de alimento y la alimentación de iniciación y tiene una resolución de tiempo de segundos, y la iniciación de POR y el consumo de alimentos puede ser controlada de forma independiente en el ensayo. Sin embargo, la forma en que la inmovilización de la mosca afecta ciertos aspectos de la conducta alimentaria (por ejemplo, la locomoción, la motivación) todavía tiene que ser investigado. Por sus excelentes exámenes comparativos de diferentes ensayos para medir el consumo de alimentos en Drosophila mílanogaster y para ayudar a los investigadores para encontrar el más adecuado, consulte los informes de Deshpande y Marx 13, 22.
El ensayo CAFE evita algunas de las desventajas de otros ensayos descritos anteriormente y combina la simplicidad de uso con la medición fiable de la ingesta de alimentos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo CAFE y que muestran una modificación sencilla configuración para reducir la evaporación. Los resultados representativos, incluyendo un ensayo de dos manjares (a corto y largo plazo) y la absorción de sacarosa de las moscas se demuestra. En la discusión comparamos nuestro método descrito con formas alternativas de realizar el ensayo CAFE, y poner de relieve las limitaciones potenciales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El informe describe el ensayo de café en una manera paso a paso, centrándose en la configuración técnica y su desempeño exitoso en el laboratorio. Debido a su simplicidad, este ensayo también se podría utilizar educativamente como un experimento de la escuela. Los ejemplos muestran que el ensayo permite la investigación de la detección de alimentos, la preferencia y el consumo en Drosophila melanogaster durante períodos de tiempo cortos y más largos (horas o días). El ensayo CAFE se ha utilizado amp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.
Materials
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied | ||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x29 x18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer`s Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1200g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
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