إنشاء خلايا التكاثري رباعي الصيغة الصبغية من Nontransformed الخلايا الليفية الإنسان
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
وقد لوحظ تعدد الصيغ الصبغية ليس فقط في الأنسجة المتخصصة من أنواع الثدييات ولكن أيضا في مجموعة متنوعة من الحالات المرضية، مثل السرطان والأمراض التنكسية. وغالبا ما يلاحظ المتعددة الصبغيات (ومعظمهم من رباعي الصيغة الصبغية) الخلايا في preneoplastic الآفات من الأنسجة البشرية، مثل المريء 1،2 أو الحرشفية الآفات باريت داخل الظهاري لعنق الرحم 3،4، وكان ينظر إلى أن يكون مصدرا للخلايا مختل الصيغة الصبغية الخبيثة في تلك الأنسجة 5 (6). على الرغم من أن يقترح تحويل رباعي الصيغة الصبغية إلى خلايا مختل الصيغة الصبغية يمكن أن يكون حدثا بالغ الأهمية في المراحل المبكرة من تكون الأورام، والآليات التي تشارك في هذه العملية ليست مفهومة تماما. ويرجع هذا جزئيا لا يوجد نموذج في المختبر كانت متاحة حيث nontransformed الخلايا البشرية المتعددة الصبغيات أن ينتشر.
قد يسببها بعض الباحثين الرباعي في الخلايا الظهارية الإنسان nontransformed من خلال توليد خلايا binucleated من يلعنهibiting السيتوبلازمي 7-9. في هذه الطريقة، ومع ذلك، يجب القضاء على الخلايا مضاعفا غير الضرورية التي كتبها مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS) 7،8 أو الاستنساخ عن طريق الحد من تخفيف 9. لأن هذه الإجراءات هي شاقة وليس من السهل القيام بها، ابسط الطرق لإقامة المرغوب فيها خلايا رباعي الصيغة الصبغية nontransformed للبحث في هذا المجال.
في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول لإنشاء خلايا رباعي الصيغة الصبغية التكاثري من الخلايا الليفية الإنسان العادي أو الخلايا الليفية الإنسان، خلدت التيلوميراز بإجراءات بسيطة نسبيا. إجراءات استخدام المغزل demecolcine السم (DC) إلى اعتقال خلايا مضاعفا في الانقسام، والخلايا الإنقسامية التي جمعتها تنفض تعامل مع مزيد من العاصمة. الخلايا الإنقسامية مضاعفا تعامل مع العاصمة لفترة طويلة من الوقت تحول إلى خلايا G1 رباعي الصيغة الصبغية، وهذه الخلايا تتكاثر الخلايا كما رباعي الصيغة الصبغية بعد اعتقال النمو لعدة أيام بعد إزالة المخدرات. يوفر هذا البروتوكولوسيلة فعالة لخلق نموذجا مفيدا لدراسة العلاقة بين عدم الاستقرار كروموسوم وإمكانات أنكجنيك من الخلايا البشرية المتعددة الصبغيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
وثمة مشكلة رئيسية في تحريض الرباعي من الخلايا مضاعفا عن عوامل كيميائية، إما عن طريق مثبطات السيتوبلازمي أو مثبطات المغزل، غير أن الخلايا غالبا ما تصبح خليط من السكان مضاعفا ورباعي الصيغة الصبغية، ويجب فصل الخلايا رباعي الصيغة الصبغية من الخلايا مضاعفا. النهج الأكث?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
References
- Rabinovitch, P., et al. Predictors of progression in Barrett’s esophagus III: baseline flow cytometric variables. Am. J. Gastroenterol. 96 (11), 3071-3083 (2001).
- Galipeau, P., et al. NSAIDs modulate CDKN2A, TP53, and DNA content risk for progression to esophageal adenocarcinoma. PLoS Med. 4 (2), e67 (2007).
- Olaharski, A., et al. Tetraploidy and chromosomal instability are early events during cervical carcinogenesis. Carcinogenesis. 27, 337-343 (2006).
- Liu, Y., et al. p53-independent abrogation of a postmitotic checkpoint contributes to human papillomavirus E6-induced polyploidy. Cancer Res. 67, 2603-2610 (2007).
- Davoli, T., de Lange, T. The causes and consequences of polyploidy in normal development and cancer. Annu Rev Cell Dev Biol. 27, 585-610 (2011).
- Fox, D., Duronio, R. Endoreplication and polyploidy: insights into development and disease. Development. 140, 3-12 (2013).
- Fujiwara, T., et al. Cytokinesis failure generating tetraploids promotes tumorigenesis in p53-null cells. Nature. 437, 1043-1047 (2005).
- Ganem, N., et al. Cytokinesis failure triggers hippo tumor suppressor pathway activation. Cell. 158 (4), 833-848 (2014).
- Kuznetsova, A., et al. Chromosomal instability, tolerance of mitotic errors and multidrug resistance are promoted by tetraploidization in human cells. Cell cycle. 14 (17), 2810-2820 (2015).
- Vindeløv, L., Christensen, I. Detergent and proteolytic enzyme-based techniques for nuclear isolation and DNA content analysis. Methods Cell Biol. 41, 219-229 (1994).
- Darzynkiewicz, Z., Juan, G. DNA content measurement for DNA ploidy and cell cycle analysis. Curr Protoc Cytom. , Chapter 7: Unit 7.5 (2001).
- Knutsen, T., Bixenman, H., Lawce, H., Martin, P. Chromosome analysis guidelines preliminary report. Cancer Genet Cytogenet. 52 (1), 11-17 (1991).
- Liehr, T., et al. Multicolor FISH probe sets and their applications. Histol. Histopathol. 19 (1), 229-237 (2004).
- Ohshima, S., Seyama, A. Formation of bipolar spindles with two centrosomes in tetraploid cells established from normal human fibroblasts. Hum. Cell. 25 (3), 78-85 (2012).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Front. Oncol. 3, 198 (2013).
- Ohshima, S., Seyama, A. Establishment of proliferative tetraploid cells from telomerase-immortalized normal human fibroblasts. Genes, Chromosome Cancer. 55 (6), 522-530 (2016).
- Di Leonardo, A., et al. DNA rereplication in the presence of mitotic spindle inhibitors in human and mouse fibroblasts lacking either p53 or pRb function. Cancer Res. 57, 1013-1019 (1997).
- Andreassen, P., Lohez, O., Lacroix, F., Margolis, R. Tetraploid state induces p53-dependent arrest of nontransformed mammalian cells in G1. Mol. Biol. Cell. 12, 1315-1328 (2001).
- Vogel, C., et al. Crosstalk of the mitotic spindle assembly checkpoint with p53 to prevent polyploidy. Oncogene. 23, 6845-6853 (2004).
- Aylon, Y., Oren, M. p53: Guardian of ploidy. Mol. Oncol. 5 (4), 315-323 (2011).
- Uetake, Y., Sluder, G. Cell cycle progression after cleavage failure : mammalian somatic cells do not possess a "tetraploidy checkpoint". J. Cell Biol. 165, 609-615 (2004).
- Ganem, N., Pellman, D. Limiting the proliferation of polyploid cells. Cell. 131, 437-440 (2007).
- Ho, C., Hau, P., Marxer, M., Poon, R. The requirement of p53 for maintaining chromosomal stability during tetraploidization. Oncotarget. 1 (7), 583-595 (2010).
