Mise en place de cellules tétraploïdes proliférative de fibroblastes humains non transformés
Summary
Although proliferative polyploid cells are necessary to analyze chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is not easy. The present report describes relatively simple procedures to establish proliferative tetraploid cells free of a diploid population from normal human fibroblasts.
Abstract
Polyploid (mostly tetraploid) cells are often observed in preneoplastic lesions of human tissues and their chromosomal instability has been considered to be responsible for carcinogenesis in such tissues. Although proliferative polyploid cells are requisite for analyzing chromosomal instability of polyploid cells, creating such cells from nontransformed human cells is rather challenging. Induction of tetraploidy by chemical agents usually results in a mixture of diploid and tetraploid populations, and most studies employed fluorescence-activated cell sorting or cloning by limiting dilution to separate tetraploid from diploid cells. However, these procedures are time-consuming and laborious. The present report describes a relatively simple protocol to induce proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts with minimum contamination by diploid cells. Briefly, the protocol is comprised of the following steps: arresting cells in mitosis by demecolcine (DC), collecting mitotic cells after shaking off, incubating collected cells with DC for an additional 3 days, and incubating cells in drug-free medium (They resume proliferation as tetraploid cells within several days). Depending on cell type, the collection of mitotic cells by shaking off might be omitted. This protocol provides a simple and feasible method to establish proliferative tetraploid cells from normal human fibroblasts. Tetraploid cells established by this method could be a useful model for studying chromosome instability and the oncogenic potential of polyploid human cells.
Introduction
Polyploidy a été observée non seulement dans les tissus des espèces de mammifères spécialisés, mais également dans une variété d'états pathologiques tels que le cancer et les maladies dégénératives. ( La plupart des cellules polyploïdes tétraploïdes) sont souvent observées dans les lésions précancéreuses de tissus humains, tels que l' œsophage 1,2 ou squameuses lésions intra – épithéliales de Barrett du col 3,4, et ont été considérés comme étant la source des cellules aneuploïdes malignes dans les tissus 5 , 6. Bien qu'il soit suggéré que la conversion de tétraploïdes à des cellules aneuploïdes pourrait être un événement crucial dans les premières étapes de la tumorigenèse, les mécanismes impliqués dans ce processus ne sont pas complètement comprises. Ceci est en partie parce qu'aucun modèle in vitro a été disponible , où les cellules humaines polyploïdes non transformées peuvent se propager.
Certains chercheurs ont induit tétraploïdie dans les cellules épithéliales humaines non transformées par la génération de cellules binucléées par inhibiting cytokinesis 7-9. Dans ce procédé, cependant, les cellules diploïdes inutiles doivent être éliminées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) 7,8 ou le clonage par dilution limitante 9. Parce que ces procédures sont laborieuses et pas facile à réaliser, des méthodes plus simples à mettre en place des cellules tétraploïdes non transformées sont souhaitées pour la recherche dans ce domaine.
Dans le présent rapport, nous décrivons un protocole pour établir des cellules tétraploïdes prolifératives de fibroblastes humains normaux ou des fibroblastes humains télomérase immortalisés par des procédures relativement simples. Les procédures utilisent la broche poison démécolcine (DC) pour arrêter les cellules diploïdes en mitose, et les cellules mitotiques recueillies par secouer sont encore traités avec DC. les cellules mitotiques diploïdes traitées avec courant continu pour convertir le temps prolongé dans les cellules G1 tétraploïdes, et ces cellules proliférer les cellules tétraploïdes que, après un arrêt de croissance pendant plusieurs jours après le retrait du médicament. Ce protocole prévoitune méthode efficace pour créer un modèle utile pour étudier la relation entre l'instabilité chromosomique et le potentiel oncogénique de cellules humaines polyploïdes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un problème majeur dans l'induction de tétraploïdie à partir de cellules diploïdes par des agents chimiques, soit par des inhibiteurs de la cytokinèse ou par des inhibiteurs de la broche, est que les cellules deviennent souvent un mélange de populations diploïdes ou tétraploïdes et les cellules tétraploïdes doivent être séparés des cellules diploïdes. La plupart des approches communes pour l'isolement d'une population tétraploïde exempte de cellules diploïdes utilisent FACS ou le clonage p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Mrs. Matsumoto for the technical assistance.
Materials
| MEM-α | Sigma-Aldrich | M8042-500ML | |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T4174 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | 172012-500ML | |
| Demecolcine solution (10 μg/mL in HBSS) | Sigma-Aldrich | D1925-10ML | |
| BD CycleTES Plus DNA Reagent Kits | BD Biosciences | #340242 | For examination of DNA ploidy by flow cytometry |
| Human chromosome multicolor FISH probe 24XCyte | MetaSystems | #D-0125-060-DI | Specialized filter set and software for mFISH analysis are necessary |
| Isis imaging system with mFISH software | MetaSystems | Specialized probe kit is necessary |
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