心機能の研究のための解剖と観察ハニービー背側の船

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

この方法論の全体的な目標は、研究者が迅速かつ容易に観察し、薬理学的薬剤は、ミツバチの心拍数に与える影響を定量化できるようにすることです。ミツバチは、他の昆虫のように、血体腔として知られている体腔、全体を通して、血リンパ、血液の昆虫同等のものを広めるオープン循環系を持っています。血リンパの循環が栄養素、免疫因子、老廃物、ならびに神経ホルモンおよび他のシグナル伝達分子¹の輸送のために不可欠です。循環は昆虫の背側正中線だけでなく、アクセサリー拍動器官に沿って延びている背の容器、によって促進されます。背容器は腹部と胸部と頭の中で大動脈に心を指定、機能的に異なる2つのセクションに分かれています。胸部や頭部に向かって心臓ポンプ血リンパ中の伝播収縮は、付属拍動器官は、四肢への血リンパの流れを確保しながら。

<pクラス= "jove_content">昆虫心臓機能、サイズ、生理学、または昆虫のライフステージに応じて、様々な方法を使用して観察することができます。幼虫以下昆虫に心拍数を観察するための一般的な方法は、生体内イメージング²の使用です。それは、腹壁を通して背容器を明確に表示することは困難であるため、この方法は、しかしながら、成人ミツバチにおいてあまり有用です。ミツバチなどの昆虫、様々な心拍数を記録するための確立されたアプローチは、サーミスタは、心臓拍動^3,4を検出するために、昆虫の外側に適用される利用接触サーモグラフィの使用です。成体ミツバチにおける心拍数は、電気インピーダンス信号^4,5を測定するために電気技術を使用して記録されています。この技法は、心臓への次の動物に電極を挿入し、心拍^4を記録するため^のインピーダンス変換器の使用を必要とします。同様に、心電図はdetecするために使用されています心臓によって生成され、心臓の活動⁶の変化を観察するために蜂のビデオ録画と組み合わせた電気信号をtは。これらのアプローチの明確な利点は、心拍数ではなく、対象における生理学的応答の全範囲の可用性を保証するのに役立つ解剖標本、よりも、そのまま、生きている蜂で評価されていることです。これらのアプローチの課題は、被写体、心拍数を変化させるだけでなく、薬理学的薬剤をテストするときに、適切な配信方法を決定するかもしれない外部の変数と刺激を制限する必要の固定化や麻酔のための会計が含まれています。

ハチ心臓活動を研究するために使用されている別のアプローチは、部分的に、力変位変換器^7を使用して^、背部の血管収縮を測定し、その後、心臓を露出させるために、昆虫を分析することです。このプロトコルでは、心臓は継続的に生理食塩水やテストの共同の実行に浴びますmpoundsは、対象⁷への適用のために、この溶液中に溶解することができます。この方法及びそれらを前述の有意差は、腹側神経索は、中枢神経系は、心拍数^5の調節に再生するために示されている役割を排除する、除去することです。結果は通常、非常に不安定なあるベースラインハートビートは、典型的には、生きている昆虫^5,7で観察されるよりもはるかに低い周波数と振幅で安定するということです。どのようなこれらの方法の全てに共通しているの彼らが行われるために、ある程度の専門知識に加えて、高度に専門化し、しばしば高価な機器を必要とするということです。おそらく、最大の欠点は、これらのアプローチのいずれも、そのような潜在的にcardiomodulatory化合物のライブラリーをスクリーニングするように被験者の数が多い、試験伴う実験に特に適していないことです。

ここで説明されたアプローチの最大の強みそのシンプルさです。プロトコルは習得が比較的容易であり、セットアップは少しスペースを必要とし、最小限の金融入力が必要です。方法はいくつかの蜂、いくつかの手術器具、等張液、およびデジタル顕微鏡やデジタルカメラとの伝統的な顕微鏡のいずれかより少しが必要です。ハチは、背側血管を可視化するために解剖され、デジタルビデオは薬剤による治療前後の心拍数を記録するために使用されます。録画は、心拍数の変化を観察するために実際に必要ではないが、それは非常にスループットを増加させる（ すなわち 、一定時間内に処理可能な被験者の数）。研究者は一度にビデオの多数を記録し、後で都合のよいときにこれらのビデオを採点することによって、効率を最大限に高めることができます。このアプローチのもう一つの利点は、ビデオは調査員が採点処理が中断されるべきで、最初からやり直す、とvのためのそれを容易にすることを可能にするということですiewerバイアスを減少させるために治療を知らされます。

Protocol

被験者の1収集と準備コロニーから蜂の適切な数を収集します。 注：必要な数は、規模や範囲の実験だけでなく、研究者のスキルだけでなく、依存します。 2つの治療グループでは、グループごとに10蜂の所望のサンプルサイズである場合たとえば、合理的に熟練した研究者は失敗した解剖を考慮して、少なくとも30蜂を集めるかもしれないし、スコアに20便利な動画で終わります?…

Representative Results

このプロトコルを使用して試験される可能性があり薬理学的に活性な化合物の多くは水溶性ではないので、試験化合物が背容器を浸すために使用される等張液を介して配信されることを可能にする信頼性の高い溶媒が必要です。ジメチルスルホキシド（DMSO）は、一般に、動物8に実験薬物および他の化合物を送達するためのビヒクルとして使用される溶剤であ…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments