مسح بروتوكولات المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لإشكالية النبات، طلائعيات بيضية، وعينات الفطرية
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
وتشمل المشاكل المشتركة في تجهيز العينات البيولوجية لالملاحظات مع المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) انهيار الخلية، ومعالجة عينات من microenvironments الرطب وتدمير الخلايا. باستخدام الأنسجة الشباب الأزهار، الخراجات طلائعيات بيضية، وجراثيم الفطريات (غاريقونيات) كأمثلة، بروتوكولات محددة لمعالجة عينات الحساسة موصوفة هنا أن التغلب على بعض التحديات الرئيسية في معالجة عينة لالتقاط الصور تحت SEM.
الخلايا الإنشائية نباتية ثابتة مع القوات المسلحة الأنغولية (-الفورمالين الخل من الكحول) ومعالجتها مع نقطة مجفف الحرجة (CPD) لم يظهر انهارت الجدران الخلوية أو أجهزة مشوهة. هذه النتائج هي حاسمة لإعادة إعمار تنمية الأزهار. إجراءات مماثلة على أساس وثيقة البرنامج القطري لعينات من microenvironments الرطبة، مثل الخراجات طلائعيات بيضية الثابتة غلوتارالدهيد، هو الأمثل لاختبار النمو المتفاوت للخصائص التشخيصية (على سبيل المثال، العمود الفقري الكيس) على أنواع مختلفة من سوbstrates. وتجنب تدمير خلايا ممرضة تعلق على جراثيم الفطريات بعد الإماهة، والجفاف، ومعاملة CPD، خطوة مهمة لمزيد من الدراسات الفنية لهذه الخلايا.
البروتوكولات بالتفصيل هنا تمثل منخفضة التكلفة وبدائل سريعة لاقتناء صور ذات نوعية جيدة لإعادة بناء عمليات النمو ودراسة الخصائص التشخيصية.
Introduction
في علم الأحياء، وقد تم تمديد استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) للدراسات التطور الهيكلي، مورفولوجيا المقارن، تطوير الجهاز، وتوصيف السكان أو الأنواع 1. مع عرض ثنائي الأبعاد للهياكل مجهرية، مجالات مثل micromorphology والنظاميات استفادت من التقدم تقنية ووزارة شؤون المرأة منذ النصف الثاني من القرن التاسع 20. على سبيل المثال، فإن إدخال منهجية تفل طلاء في 1970s الملاحظات الممكنة من المواد الحساسة مثل قمم تبادل لاطلاق النار والزهور تعزيز التصوير من الأنسجة غير موصل 2 و 3. يستخدم SEM الالكترونات طرد من سطح العينة لإنتاج التضاريس في بيئة عالية فراغ 4.
وتركز الدراسات التي تنطوي على ووزارة شؤون المرأة في كل من الاستدلال من الشخصيات الهيكلية وإعادة بناء growtعمليات ح. وقد تم اكتشاف الشخصيات الهيكلية الجديدة ذات الصلة لتصنيف والنظاميات من مجموعة واسعة من الكائنات الحية من الملاحظات ووزارة شؤون المرأة. على سبيل المثال، والصفات النباتية المستخدمة لتشخيص أنواع أو تصنيفات supraspecific، مثل حفر vestured من الخشب 5 والتنوع وصمة عار 6، الرحيقية والأزهار التشكل 7 و 8 و تفاصيل شعري الشكل 9، وحبوب اللقاح 10، 11، لا يمكن تصور بشكل صحيح من دون ووزارة شؤون المرأة. وقد تحققت الملاحظات ناجحة مع SEM التقليدية أيضا لفترة طويلة الكائنات الثابتة الفورمالين 12 و معشبة النباتات. نماذج 13.
من ناحية أخرى، ودراسات إعادة بناء عمليات النمو باستخدام SEM تشمل مجموعة واسعة من المواضيع، مثل تطوير الجهاز 14، infections الناجم عن البكتيريا 15، مصنع الجذر علم وظائف الأعضاء 16 وآليات مرفق الطفيلي المضيف 17 و 18 و آثار المخدرات على الطفيليات 19، mycoparasitism وتضاد 20 و 21 و تشوه نمو 22، والتنمية المقارنة من الأفراد البرية ومتحولة 23، ودورة حياة كاملة 24. على الرغم من أن المجاهر المسح البيئي الإلكترون (ESEM) 25 قد يكون من المزايا الهامة لمراقبة العينات البيولوجية الرطب في عمليات النمو والمواد الحساسة ربما لا يزال خطر حتى في حالة انخفاض فراغ من ESEM)، وتحتاج إلى معالجتها على نحو كاف لتجنب فقدان الملاحظة المورفولوجية للقيمة.
في هذه الورقة، ومراجعة بروتوكولات محددة لمراقبة SEM من ثلاث فرقيتم تقديم أنواع erent العينات: الخلايا الإنشائية الأزهار، الفطريات البيضية (الرمية)، والمواد الفطرية. هذه البروتوكولات ترجمة تجربة دراساتنا السابقة استنادا SEM-26، 27، 28، 29، 30، 31، 32، 33، حيث تم العثور على صعوبات محددة والحلول البديلة. في حالة محطة التنموية المقارن والدراسات الهيكلية، بدأ استخدام SEM في 1970s 34 و 35، ومنذ ذلك الحين، اكتشف الباحثون أن بعض ميزات الزهور هي أكثر عطوب مما كان يعتقد سابقا 36. إعادة الإعمار للتنمية الأزهار ينطوي على الاستيلاء على جميع مراحل بين الخلايا الإنشائية الأزهار الشباب وanthesis. للوصول إلى هذا الهدف، فمن ESSEntial إلى أن تضاريس العينة وسلامة جدار الخلية وعدم المساس بعد تثبيت والجفاف لاحق. الخلايا الإنشائية الأزهار الشباب معرضة بشكل خاص لانهيار جدار الخلية (أرقام 1A، 1B). وبالمثل، الهياكل الحساسة مثل الرحيق، بتلات، الوصمات ومباغات تتطلب بروتوكولات فعالة وغير ضارة. يلخص هذا الاستعراض بروتوكول الأمثل للحفاظ على الأنسجة الشباب وحساسة سليمة للتصوير ووزارة شؤون المرأة.
في حالة الفطريات البيضية (Stramenopiles) وهي إحدى المجموعات الأكثر تنوعا وانتشارا من الطفيليات، مع المضيفين تتراوح بين الميكروبات والنباتات لاللافقاريات والفقاريات 37 – هناك جراثيم التي تنمو وتتطور في بيئة رطبة. وتمثل هذه الحالة تحديا للمراقبة ووزارة شؤون المرأة لأن الجراثيم تحتاج الركيزة المناسبة ليست مناسبة للبروتوكولات ووزارة شؤون المرأة القياسية. بين الفطريات البيضية، نوعا من الرمية ذات أهمية خاصة لأنها كاليفورنيان تسبب تخفيضات حادة في aquacultures ومصائد الأسماك، وأعداد البرمائيات 38. خصائص Micromorphological، مثل العمود الفقري مدمن مخدرات الخراجات، وقد وجد أن تكون مفيدة لتحديد الأنواع من الرمية، وهو أمر أساسي لوضع ضوابط العدوى والعلاجات المحتملة 39. هنا، هناك بروتوكول تجريبي لمقارنة أنماط نمو العمود الفقري من الخراجات على ركائز المختلفة والتعامل مع عينة لإعداد حاسم مجفف نقطة (CPD) والملاحظة ووزارة شؤون المرأة لاحقة.
وفي حالة ثالثة، وهناك نتائج مثيرة للاهتمام التي ظهرت بعد عملية تفتيش للأبواغ الفطريات Phellorinia herculanea و. و النجمية. نوفا (غاريقونيات) 31. جنبا إلى جنب مع الجراثيم، تم تحديد مجموعة من الخلايا الحضانة غير متوقعة تحت SEM. مع البروتوكولات التقليدية السابقة، والمواد غير المعالجة، وجاء الخلايا الممرضة أوور انهارت تماما (الشكل 1C). مزيد من استنتاجات حول معينة الأنسجة المرتبطة الجراثيم ويمكن إجراء مع تعديلات بسيطة ولكنها حاسمة لنهج قياسية الموصوفة هنا (1D الشكل).
في هذا الاستعراض، وهناك بروتوكولات وإجراءات تفصيلية SEM التي يمكن استخدامها للتعامل مع مختلف المشاكل المرتبطة الملاحظة ووزارة شؤون المرأة في كاسيات البذور، الفطريات البيضية، وغاريقونيات، مثل انهيار الخلايا وتقلص الأنسجة بارضي والنمو غير الأمثل في العمود الفقري الكيس، وتدمير الأنسجة سريعة الزوال، على التوالي.
الشكل 1: مقارنة بين عينات علاجها بدون (أ، ج) ومع (ب، د) البروتوكول FAA الإيثانول-CPD. (أ – ب) براعم الزهور من Anacyclus المقرعية، منتصف التنمية. برعم تعامل مع رباعي أكسيد الأوزميوم 46 </ sup> في (أ) و برعم تعامل مع بروتوكول FAA-CPD (ب). (ج – د) ممرضة الخلايا مع أبواغ Phellorinia herculanea و. النجمية. المجففة عينات من دون أي علاج (ج) ومع بروتوكول صفها هنا لغاريقونيات (د). الجراثيم في البرتقال. المقاييس: (أ ب) 100 ميكرون، (CD) 50 ميكرون. تم التقاط الصور بواسطة Y. رويز-ليون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وفيما يتعلق البروتوكولات ووزارة شؤون المرأة القياسية، والإجراءات المعروضة هنا تشمل سريعة نسبيا، وسهلة لمتابعة، ومنهجيات منخفضة التكلفة. اعتمادا على كمية من العينات وعلى سهولة المعالجة، فإنه يأخذ 4-5 أيام للحصول على صور ذات جودة جيدة. بما في ذلك احتياطات السلامة الك?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد لقي هذا المشروع بتمويل من البحث والابتكار برنامج الاتحاد الأوروبي أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة رقم 634429. ويعكس هذا المنشور وجهات النظر فقط للمؤلف، والمفوضية الأوروبية لا يمكن أن يكون مسؤولا عن أي استخدام التي يمكن أن تكون مصنوعة من المعلومات الواردة فيه. ونحن نعترف أيضا المساهمة المالية التي قدمها ريال حديقة النباتية، CSIC. ريال عن امتنانه للاتحاد الأوروبي [إيتن-SAPRO-238550] لدعم أبحاثها في الرمية. نحن نريد أيضا أن أشكر فرانسيسكو كالونج لليرجى تقديم الصور herculanea Phellorinia وباء. بيويو لتجهيز العينات (الشكل 5). وقد تم نقل كل الصور من قبل الخدمة ووزارة شؤون المرأة في ريال حديقة النباتية، CSIC في مدريد.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
