Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Summary

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Abstract

Häufige Probleme bei der Verarbeitung von biologischen Proben für Beobachtungen mit dem Rasterelektronenmikroskop (SEM) umfassen Zellkollaps, Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen und Zellzerstörung. Mit jungen Blütengewebe, oomycete Zysten und Pilzsporen (Agaricales) als Beispiele spezielle Protokolle empfindliche Proben zu verarbeiten hier beschrieben werden, die einige der wichtigsten Herausforderungen in der Probenbehandlung für die Bilderfassung unter dem SEM überwinden.

Floral meristems mit FAA fixiert (Formalin-Acetic-Alkohol) und mit dem kritischen Punkt Dryer (CPD) verarbeitet nicht Zellwände oder verzerrt Organe kollabiert Display. Diese Ergebnisse sind von entscheidender Bedeutung für die Rekonstruktion der Blütenentwicklung. Eine ähnliche CPD-basierte Behandlung von Proben aus nassen Mikroumgebungen, wie beispielsweise die mit Glutaraldehyd fixierten Oomyceten Zysten ist optimal die differentielle Wachstum von diagnostischen Eigenschaften zu testen (beispielsweise die Zyste Stacheln) auf verschiedenen Arten von substrates. Die Zerstörung der Nährzellen an Pilzsporen wurde nach Rehydrierung vermieden, Dehydrierung und der CPD-Behandlung, ein wichtiger Schritt für die weitere funktionelle Studien dieser Zellen.

Die Protokolle detailliert hier repräsentieren preiswerte und schnelle Alternativen für den Erwerb von qualitativ gute Bilder Wachstumsprozesse zu rekonstruieren und diagnostischen Eigenschaften zu studieren.

Introduction

In der Biologie ist die Verwendung von Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Untersuchungen von Strukturentwicklung erweitert, vergleichende Morphologie, Organentwicklung und Charakterisierung von Populationen oder ¹ – Arten. Mit seiner zweidimensionalen Ansicht von mikroskopischen Strukturen, Bereiche wie Mikromorphologie und Systematik profitierte von SEM – Technik Fortschritte seit der zweiten Hälfte des ^20. Jahrhunderts. Beispielsweise hat die Einführung der Sputter – Beschichtungsmethode in den 1970er Jahren möglich , Beobachtungen von empfindlichen Materialien wie Spross Scheiteln und Blüten der Abbildungs aus nichtleitendem Geweben verbessern ^{2, 3.} SEM verwendet von der Oberfläche der Probe emittierten Elektronen , die Topographie in einer Hochvakuumumgebung ⁴ zu reproduzieren.

Studien SEM werden, die sowohl in der Ableitung von Struktur Zeichen konzentriert und den Wiederaufbau von growth Prozesse. Neue strukturelle Zeichen relevant für die Taxonomie und Systematik von einem breiten Spektrum von Organismen wurden aus SEM Beobachtungen entdeckt. Zum Beispiel Pflanzeneigenschaften für Arten , Diagnose oder supraspecific Klassifikationen, wie die Verzierte Tüpfel aus Holz ^_5, Stigma Vielfalt ^6, nectary und floralen Morphologie ^{7, 8,} trichome Details ⁹ und Pollenkörner ¹⁰ werden richtig ^{sichtbar, 11,} kann nicht verwendet werden , ohne SEM. Erfolgreiche Beobachtungen mit konventionellen SEM wurden für Langzeit Formalin fixierten Organismen ¹² und Anlage Herbarbelege ¹³ auch erreicht.

Auf der anderen Seite, Studium der Rekonstruktion von Wachstumsprozessen REM umfassen ein breites Spektrum von Themen wie Organentwicklung ^14, infections induziert durch Bakterien ^15, Pflanzenwurzel Physiologie ^16, Parasit-Wirt – Befestigungsmechanismen ^{17, 18,} Arzneimittelwirkungen auf Parasiten ^19, Mycoparasitismus und antibiotische ^{20, 21,} Wachstum Malformation ^22, vergleichende Entwicklung von wild und mutierten Individuen ²³ und gesamten Lebenszyklus ^24. Obwohl Umwelt Rasterelektronenmikroskope (ESEM) ²⁵ wichtige Vorteile für die Beobachtung von nassen biologischen Proben in Wachstumsprozesse haben können, können empfindliche Material noch einmal in dem Niedervakuumzustand des ESEM) beeinträchtigt werden, und muss ausreichend Verlust zu vermeiden verarbeitet werden von wertvollen morphologischen Beobachtung.

In diesem Papier, eine Überprüfung der spezifischen Protokolle für die SEM-Beobachtung von drei diffErent Probentypen vorgestellt: Blumen Meristeme, Oomyceten (Saprolegnia) und Pilzmaterial. Diese Protokolle kompilieren die Erfahrung unserer bisherigen SEM-basierten Studien ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} in denen besondere Schwierigkeiten und alternative Lösungen gefunden. Im Falle von Pflanzenvergleichs Entwicklungs- und Strukturstudien begann die Verwendung von SEM in den 1970er Jahren ^{34, 35,} und seitdem entdeckten Forscher , dass bestimmte Blumen Merkmale labiler sind als bisher ³⁶ gedacht. Die Rekonstruktion der Blütenentwicklung beinhaltet die Erfassung aller Stufen zwischen jungen Blumen Meristeme und anthesis. Um dieses Ziel zu erreichen, ist es Essential dass die Probentopographie und der Zellwandintegrität werden nach der Fixierung und nachfolgende Dehydratisierung nicht beeinträchtigt wird. Junge Blumen Meristeme sind besonders anfällig für Zellwand Zusammenbruch (1a, 1b). In ähnlicher Weise empfindliche Strukturen wie Nektarien, Blütenblätter, Stigmata und Sporangien erfordern effektive und undamaging Protokolle. Diese Übersicht fasst ein optimales Protokoll junge und empfindliche Gewebe intakt für SEM-Bildgebung zu halten.

Im Falle der Oomyceten (Stramenopiles) -on der vielfältigsten und weit verbreiteten Gruppen von Parasiten, die mit den Hosts von Mikroben und Pflanzen zu wirbellosen Tieren und Wirbeltieren im Bereich ³⁷ – gibt es Sporen, die in einer feuchten Umgebung wachsen und sich entwickeln. Diese Bedingung stellt eine Herausforderung für SEM-Beobachtung, da die Sporen ein ausreichendes Substrat nicht geeignet für Standard-SEM-Protokolle benötigen. Unter den Oomyceten – Arten Saprolegnia sind von besonderem Interesse , weil sie caverursachen n erheblichen Kürzung der Aquakultur, Fischerei und Amphibienpopulationen ^38. Mikromorphologische Eigenschaften, wie die Hakenstacheln von Zysten, haben sich als nützlich erwiesen Arten von Saprolegnia zu identifizieren, die von grundlegender Bedeutung ist , um Infektionskontrollen und mögliche Behandlungen ³⁹ herzustellen. Hier gibt es ein Versuchsprotokoll, um die Muster der Wirbelsäule Wachstum von Zysten auf verschiedenen Substraten zu vergleichen und die Probe für die kritischen Punkt Trockner (CPD) Herstellung und anschließende SEM Beobachtung zu manipulieren.

In einem dritten Fall gibt es interessante Erkenntnisse , die nach einer Inspektion der Sporen der Pilze Phellorinia herculanea f kam. stellata f. nova (Agaricales) ^31. Zusammen mit den Sporen, wurde eine Gruppe von unerwarteten nursery Zellen unter dem SEM identifiziert. Bei früheren traditionellen Protokollen und unbehandeltem Material, kamen die Nährzellen out vollständig zusammengebrochen (Abbildung 1c). Weitere Rückschlüsse insbesondere auf die Sporen dazugehörigen Gewebe kann mit den einfachen , aber entscheidenden Änderungen an den Standardansätze hier (Abbildung 1d) beschrieben , hergestellt werden.

In dieser Bewertung gibt es detaillierte SEM-Protokolle, die mit unterschiedlichen Problemen verwendet werden können, mit SEM-Betrachtung bei Angiospermen, Oomyceten und Agaricales, wie Zellkollaps und Meristemgewebe Schrumpfung, nicht das optimale Wachstum von Zysten Stacheln und Zerstörung fertig zu werden ephemeren Gewebe, respectively.

Abbildung 1: Vergleich von Proben behandelt , ohne (a, c) und mit (b, d) das Protokoll FAA-Ethanol-CPD. (A – b) Blumenknospen von Keulen-Bertram, Mid-Entwicklung. Bud mit Osmiumtetroxid behandelt ^{46 <}/ sup> (a) und Knospe mit der FAA-CPD – Protokoll (b) behandelt. (C – d) Krankenschwester Zellen mit Sporen von Phellorinia herculanea f. stellata. Getrocknete Proben ohne Behandlung (c) und mit dem Protokoll hier für Agaricales beschrieben (d). Spores in Orange. Waage: (ab) 100 & mgr; m (cd) 50 & mgr; m. Fotos wurden von Y. Ruiz-León genommen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

HINWEIS: Dieses Protokoll enthält sechs Hauptbereiche, drei gewidmet bestimmte Organismen (Abschnitte 1-3), und drei der Beschreibung der Verfahren, die für alle (4-6). Sternchen (*) zeigen Schritte, die von den Experimentatoren modifiziert. 1. Studium der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed Sammlung und Fixierung Wenn das Pflanzenmaterial in einem Ort ohne Zugang zu einem Abzug gesammelt wird, einführen und das Material in 70% Ethanol in Zen…

Representative Results

Floral Entwicklung und Fixierung der Entwicklung und Voll baulichen Anlagen Formed Mit dem FAA-CPD-Protokoll hier beschrieben, junge und reife Pflanzengewebe optimal fixiert und dehydriert für SEM-Bildgebung. Prozesse wie Blütenentwicklung kann rekonstruiert werden , weil die Topographie und die Form der Knospen nicht durch Zellschrumpfungs (Figuren 1b, 1d, 4a-f) verzerrt. Strukturen mit komplizierten Formen k…

Discussion

In Bezug auf die Standard-SEM-Protokolle, präsentiert die Verfahren hier sind relativ schnell, einfach zu folgen, und Low-Cost-Methoden. Je nach der Menge der Proben und auf die Leichtigkeit der Verarbeitung, dauert es vier bis fünf Tage, um Bilder von guter Qualität erhalten. Einschließlich einer angemessenen Sicherheitsvorkehrungen für die CPD und SEM-Betrieb sind die Verfahren einfach zu handhaben. Besondere Vorsicht ist mit Formalin und Glutaraldehyd (siehe Schritte 1.1.1 bis 1.1.3 und 2.1.5 des Protokolls) ent…

Materials

Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier