מיקרוסקופ אלקטרוני סורק הפרוטוקולים (SEM) עבור בעייתי הצמח, Oomycete, וכן דוגמאות פטרייתיים
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
בעיות נפוצות בעיבוד של דגימות ביולוגיות לתצפיות עם מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) כוללים קריסת התא, טיפול של דגימות microenvironments רטוב והרס התא. באמצעות רקמות פרחים צעירות, ציסטות oomycete, נבגי פטריות (Agaricales) כדוגמות, פרוטוקולים ספציפיים לעבד דגימות עדינות מתוארות כאן כי להתגבר על כמה מן האתגרים העיקריים טיפול מדגם עבור לכידת תמונה תחת SEM.
meristems הפרחוני קבוע עם ה- FAA (פורמלין-אצטית-אלכוהול) ומעובד עם שיער הנקודה הקריטי (CPD) לא גילה קרס קירות הסלולר או איברים מעוותים. תוצאות אלה הן קריטיות לבנייה מחדש של פיתוח פרחוני. טיפול דומה מבוסס CPD של דגימות microenvironments הרטוב, כגון ציסטות oomycete הקבועה glutaraldehyde, הוא אופטימלי כדי לבחון את גדילת ההפרש של מאפייני אבחון (למשל, קוצי ציסטה) על סוגים שונים של substrates. הרס של תא אחות מצורף נבגי פטריות נמנע לאחר התייבשות, התייבשות, ואת טיפול CPD, צעד חשוב עבור מחקרים תפקודיים נוסף של תאים אלה.
הפרוטוקולים המפורטים כאן מייצגים בעלות נמוכה וחלופות מהירות לרכישת תמונות באיכות טובה לשחזר תהליכי גדילה ללמוד את מאפייני אבחון.
Introduction
בביולוגיה, השימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) הוארך ללימודי האבולוציה מבניים, מורפולוגיה השוואתי, פיתוח איברים, ואפיון של אוכלוסיות או מינים 1. עם הנוף שלה דו ממדים של מבנים מיקרוסקופים, בתחומים כגון micromorphology ו סיסטמטיקה הרוויחו מן התקדמות טכניקת SEM מאז המחצית השנייה של המאה ה -20. לדוגמא, את ההקדמה של המתודולוגיה ציפוי גמגום בשנתי ה -1970 ערך מדידות אפשריות של חומרים עדינים כגון apices לירות ופרחי שיפור ההדמיה של שאינו מוליך רקמות 2, 3. SEM משתמשת האלקטרונים הנפלטים מן השטח של הדגימה כדי לשחזר את הטופוגרפיה בסביבה גבוהה ואקום 4.
מחקרים שכללו SEM מתמקדים בשני היקש תווים מבניים מחדש של growtתהליכי h. תווים מבניים חדשים רלוונטיים הטקסונומיה סיסטמטיקה של מגוון רחב של אורגניזמים התגלו מתצפיות SEM. לדוגמא, תכונות צמח בשימוש לאבחון מינים או סיווגי supraspecific, כגון בורות vestured של עץ 5, הסטיגמה מגוון 6, מורפולוגיה nectary וצמחית 7, 8, פרטים יונקים 9, ו גרגרי אבקה 10, 11, לא יכול להיות דמיינו כמו שצריך בלי SEM. תצפיות מוצלחות עם קונבנציונלי SEM הושגו גם עבור אורגניזמים קבועים בפורמלין זמן ארוך 12 ו העשבייה צמח דגימות 13.
מצד השני, מחקרי שיקום של תהליכי צמיחה באמצעות SEM מדגימים מגוון רחב של נושאים, כגון פיתוח איבר 14, infections המושרה על ידי חיידקים 15, פיזיולוגית שורש צמח 16, מנגנונים מצורפים טפיל-מארח 17, 18, שפעות תרופה על טפילים 19, mycoparasitism ו אנטיביוזה 20, 21, מום צמיחה 22, פיתוח השוואתי של אנשים פרועים מוטציה 23, ומחזורי חיים שלמים 24. למרות מיקרוסקופי אלקטרונים סורקים סביבתי (ESEM) 25 יכולים להיות יתרונות חשובים עבור התצפית של דגימות ביולוגיות רטובות בתהליכי צמיחה, חומר עדין עדיין עלול לסכן אפילו במצב הוואקום הנמוך של ESEM), וצריך להיות מעובד כראוי כדי למנוע אובדן תצפית מורפולוגיים של ערך.
במאמר זה, סקירה של פרוטוקולים ספציפיים להסתכלות SEM של שלושה diffסוגי erent של דגימות מוצגים: meristems פרחוני, oomycetes (Saprolegnia), וחומר פטרייתי. פרוטוקולים אלה לקמפל את החוויה של המחקרים SEM המבוססים הקודמים שלנו 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, שם קשיים ספציפיים פתרונות חלופיים נמצאו. במקרה של התפתחות צמח השוואתית מחקרים מבניים, השימוש SEM נכתב בשנתי ה -1970 34, 35, ומאז, חוקרים גילו כי תכונות פרחוניות מסוימות הן יותר יציבות מאשר סבר עד כה 36. שחזור הפיתוח פרחוני כרוך לכידתו של כל השלבים בין meristems הפרחוני הצעיר anthesis. כדי להגיע למטרה זו, זה essential כי הטופוגרפיה מדגם ואת שלמות דופן התא אינם בסכנה לאחר קיבוע והתייבשות שלאחר מכן. Meristems הפרחוני הקטן פגיע במיוחד כדי התמוטטות דופן תא (1a הדמוי, 1b). בדומה לכך, מבנים עדינים כגון nectaries, עלי כותרת, סטיגמות sporangia דורשים פרוטוקולים יעילים undamaging. סקירה זו מסכמת פרוטוקול אופטימלי לשמור רקמות צעירות ועדינות תילן הדמית SEM.
במקרה של oomycetes (Stramenopiles) -One של קבוצות המגוונות והנפוצות ביותר של טפילים, עם מארחים החל חיידקים וצמחים חסרי חוליות ובעלי חוליות 37 – יש נבגים כי לגדול ולהתפתח בסביבה רטובה. מצב זה מהווה אתגר עבור תצפית SEM כי הנבגים צריכים מצע הולם לא מתאים פרוטוקולי SEM סטנדרטיים. בין oomycetes, מינים של Saprolegnia הם בעלי עניין מיוחד, כי הם can לגרום ירידות קשות aquacultures, דיג, ואוכלוסיות דוחות 38. מאפיינים Micromorphological, כגון קוצים מעוקלים של ציסטות, כבר מצאו להיות שימושי כדי לזהות מינים של Saprolegnia, שהוא היסוד להקים שולטת זיהום טיפולים פוטנציאליים 39. הנה, יש פרוטוקול הניסוי להשוות את דפוסי הצמיחה עמוד השדרה של ציסטות על מצעים שונים כדי לתפעל את המדגם עבור מייבש נקודה קריטית (CPD) הכנה והתבוננות SEM שלאחר מכן.
במקרה שלישי, ישנם ממצאים מעניינים שעלו אחרי בדיקה של נבגים של f herculanea פטריות Phellorinia. f stellata. נובה (Agaricales) 31. יחד עם הנבגים, קבוצת תאי משתלה לא צפויים זוהתה תחת SEM. עם פרוטוקולים מסורתיים קודמים וחומר שלא טופל, התאים נכנסו אחות out קרסה לחלוטין (איור 1 ג '). מסקנות נוספות על רקמות מסוימות בקשר אל הנבגים יכולות להתבצע עם השינויים פשוטים אך חיוניים הגישות הסטנדרטיות המתואר כאן (1D איור).
בסקירה זו, ישנם פרוטוקולים מפורטים SEM, שניתן להשתמש בהם כדי להתמודד עם בעיות שונות הקשורות תצפית SEM, מכוסי הזרע, oomycetes, ו Agaricales, כגון קריסה התא מתכווץ רקמות meristematic, שאינו אופטימלי לצמיחה של הקוצים ציסטה, והרס של רקמות חלוף, בהתאמה.
איור 1: השוואה בין דגימות מטופלים ללא (א, ג) ועם (ב, ד) ה- FAA-אתנול-CPD פרוטוקול. (א – ב) ניצנים פרחוניים של clavatus קַחֲוִינָה, פיתוח האמצע. באד שטופל tetroxide אוסמיום 46 </ sup> (א) ובאד שטופלו בפרוטוקול ה- FAA-CPD (ב). (ג – ד) אחות תאים עם נבגים של herculanea f Phellorinia. stellata. יבשי דגימות ללא (ג) טיפול ועם הפרוטוקול כאן תאר Agaricales (ד). נבגים בכתום. סולמות: (ab) 100 מיקרומטר, (CD) 50 מיקרומטר. התמונות צולמו על ידי י 'רואיז-ליאון. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
עם כל כבוד פרוטוקולי SEM רגילים, את שיטות העבודה שהוצגו כאן כוללות יחסית מהירות, קל לעקוב, ומתודולוגיות בעלות נמוכה. בהתאם לכמות של דגימות על מנת להקל על עיבוד, זה לוקח ארבעה עד חמישה ימים כדי לרכוש תמונות באיכות טובה. כוללים אמצעי בטיחות נאות עבור מבצע CPD ו SEM, הנהלים הם ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרויקט זה קבל מימון מן המחקר של Horizon 2020 ותכנית חדשנות האיחוד האירופי תחת מס 'הסכם מענק 634429. פרסום זה משקף את הדעות רק של המחבר, והנציבות האירופיות לא יכולות להיות אחראיות על כל שימוש אשר עשוי להיות של המידע כלול בו. אנחנו גם מכירים את התרומה הכספית של Real Jardin Botanico, CSIC. SR הוא מודה האיחוד האירופי [ITN-Sapro-238,550] על התמיכה מחקרה ב Saprolegnia. כמו כן, אנו רוצים להודות פרנסיסקו Calonge עבור חביב לספק את התמונות Phellorinia herculanea ו- B. פואיו לעיבוד דגימות (איור 5). כל התמונות צולמו על ידי שירות SEM בבית Real Jardin Botanico-CSIC במדריד.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
