समस्याग्रस्त प्लांट, Oomycete, और फफूंद नमूने के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) प्रोटोकॉल स्कैन
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) के साथ टिप्पणियों के लिए जैविक नमूने के प्रसंस्करण में आम समस्याओं सेल पतन, गीला microenvironments और सेल विनाश से नमूने के उपचार में शामिल हैं। नाजुक नमूने यहां बताए गए SEM के तहत छवि पर कब्जा के लिए नमूना उपचार में मुख्य चुनौतियों में से कुछ पर काबू पाने की प्रक्रिया करने के लिए युवा पुष्प ऊतकों, oomycete अल्सर, और कवक बीजाणुओं (Agaricales) उदाहरण के रूप में विशिष्ट प्रोटोकॉल का उपयोग करना,।
पुष्प मेरिस्टेमों एफएए के साथ तय (Formalin-एसिटिक-शराब) और महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी) के साथ कार्रवाई की सेलुलर दीवारों या विकृत अंगों ढह प्रदर्शित नहीं किया था। इन परिणामों के पुष्प विकास के पुनर्निर्माण के लिए महत्वपूर्ण हैं। ऐसे glutaraldehyde तय oomycete अल्सर के रूप में गीला microenvironments, से नमूने का एक समान सीपीडी आधारित उपचार, सु के विभिन्न प्रकारों पर नैदानिक विशेषताओं का अंतर विकास (जैसे, पुटी कांटा) का परीक्षण करने के लिए इष्टतम हैbstrates। नर्स कवक बीजाणुओं से जुड़ी कोशिकाओं के विनाश पुनर्जलीकरण, निर्जलीकरण, और सीपीडी उपचार, इन कोशिकाओं के आगे कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के बाद बचा हुआ था।
प्रोटोकॉल यहाँ विस्तृत कम लागत और अच्छी गुणवत्ता के चित्र के अधिग्रहण के विकास की प्रक्रिया को फिर से संगठित करने के लिए और नैदानिक विशेषताओं का अध्ययन करने के लिए तेजी के विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं।
Introduction
जीव विज्ञान में, स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें (SEM) संरचनात्मक विकास, तुलनात्मक आकृति विज्ञान, अंग विकास, और आबादी या प्रजातियों 1 के लक्षण वर्णन के अध्ययन के लिए बढ़ा दिया गया है। सूक्ष्म संरचनाओं के अपने दो आयामी दृष्टिकोण के साथ, इस तरह के micromorphology और व्यवस्था जैसे क्षेत्रों 20 वीं सदी की दूसरी छमाही के बाद से SEM तकनीक अग्रिमों से फायदा। उदाहरण के लिए, 1970 के दशक में धूम कोटिंग पद्धति की शुरूआत गैर प्रवाहकीय ऊतकों 2, 3 की इमेजिंग बढ़ाने ऐसे शूट apices और फूल के रूप में नाजुक सामग्री के संभावित अवलोकन किया। SEM के एक उच्च निर्वात वातावरण 4 में स्थलाकृति पुन: पेश करने नमूना की सतह से निकली इलेक्ट्रॉनों का उपयोग करता है।
SEM शामिल अध्ययन दोनों संरचनात्मक पात्रों के अनुमान और growt के पुनर्निर्माण में ध्यान केंद्रित कर रहेज प्रक्रियाओं। न्यू संरचनात्मक वर्गीकरण के लिए प्रासंगिक और वर्ण जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला की व्यवस्था SEM टिप्पणियों से खोज की गई है। उदाहरण के लिए, संयंत्र लक्षण इस तरह की लकड़ी 5, कलंक विविधता 6, nectary और पुष्प आकृति विज्ञान 7, 8, trichome विवरण 9, और पराग अनाज की पहनाया हुआ गड्ढ़े 10, 11, ठीक से बिना कल्पना नहीं की जा सकती है के रूप में, प्रजातियों निदान या supraspecific वर्गीकरण के लिए इस्तेमाल किया SEM। पारंपरिक SEM के साथ सफल टिप्पणियों को भी लंबे समय formalin तय जीवों 12 के लिए हासिल किया गया है और संयंत्र वनस्पति संग्रहालय 13 नमूनों।
दूसरी ओर, SEM का उपयोग विकास की प्रक्रिया के पुनर्निर्माण के अध्ययन में इस तरह के अंग विकास 14, infe के रूप में विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिलबैक्टीरिया 15, पौधे जड़ शरीर क्रिया विज्ञान 16, परजीवी मेजबान लगाव तंत्र 17, 18, परजीवी 19, mycoparasitism और प्रतिजीविता 20, 21, विकास कुरूपता 22, जंगली और उत्परिवर्ती व्यक्तियों 23 के तुलनात्मक विकास, और पूरे जीवन चक्र पर दवा के प्रभाव से प्रेरित ctions 24। पर्यावरण स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (ESEM) 25 विकास की प्रक्रिया में गीला जैविक नमूने के अवलोकन के लिए महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है, नाजुक सामग्री अभी भी ESEM) के कम निर्वात हालत में समझौता किया जा सकता है, और नुकसान से बचने के लिए पर्याप्त रूप से संसाधित करने की आवश्यकता के मूल्यवान रूपात्मक अवलोकन।
इस पत्र, तीन रचनाकार के SEM अवलोकन के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल की समीक्षा मेंनमूनों की erent प्रकार प्रस्तुत है: पुष्प मेरिस्टेमों, oomycetes (Saprolegnia), और फंगल सामग्री। इन प्रोटोकॉल हमारे पिछले SEM आधारित अध्ययन 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, जहां विशिष्ट कठिनाइयों और वैकल्पिक समाधान पाया गया है के अनुभव संकलन। संयंत्र तुलनात्मक विकास और संरचनात्मक अध्ययन के मामले में, SEM के उपयोग के 1970 के दशक के 34, 35 में शुरू किया था, और तब से, शोधकर्ताओं ने पाया है कि कुछ पुष्प सुविधाओं को और अधिक अस्थिर तुलना में पहले सोचा 36 हैं। पुष्प विकास के पुनर्निर्माण युवा पुष्प मेरिस्टेमों और anthesis के बीच सभी चरणों का कब्जा शामिल है। इस उद्देश्य तक पहुंचने के लिए, यह Esse हैntial कि नमूना स्थलाकृति और कोशिका दीवार अखंडता निर्धारण और बाद में निर्जलीकरण के बाद समझौता नहीं कर रहे हैं। (आंकड़े 1 ए, 1 बी) के युवा पुष्प मेरिस्टेमों विशेष रूप से सेल की दीवार ढहने की चपेट में हैं। इसी तरह, इस तरह के nectaries, पंखुड़ी, कलंक और sporangia के रूप में नाजुक संरचनाओं प्रभावी और undamaging प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। इस समीक्षा SEM इमेजिंग के लिए बरकरार युवा और नाजुक ऊतकों को रखने के लिए एक इष्टतम प्रोटोकॉल का सार।
Oomycetes (Stramenopiles) परजीवी के सबसे विविध और व्यापक समूहों में से -एक, रोगाणुओं और पौधों से अकशेरुकी और रीढ़ 37 से लेकर मेजबान टीम के साथ के मामले में – वहाँ बीजाणुओं कि आगे बढ़ने और एक गीला वातावरण में विकसित कर रहे हैं। क्योंकि बीजाणुओं एक पर्याप्त सब्सट्रेट मानक SEM प्रोटोकॉल के लिए उपयुक्त नहीं की जरूरत है इस हालत SEM अवलोकन के लिए एक चुनौती का प्रतिनिधित्व करता है। Oomycetes के बीच, Saprolegnia की प्रजातियों में विशेष रुचि के हैं क्योंकि वे सीएn aquacultures, मत्स्य पालन, और उभयचर आबादी 38 में गंभीर कटौती के कारण। इस तरह के अल्सर के आदी कांटा के रूप में Micromorphological विशेषताओं, Saprolegnia, जो संक्रमण नियंत्रण और संभावित उपचार 39 की स्थापना के लिए मौलिक है की प्रजातियों की पहचान करने के लिए उपयोगी होना पाया गया है। इधर, विभिन्न substrates पर अल्सर की रीढ़ की हड्डी विकास के पैटर्न की तुलना करने के लिए और महत्वपूर्ण बिंदु ड्रायर (सीपीडी) तैयार करने और बाद में SEM अवलोकन के लिए नमूना हेरफेर करने के लिए एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल है।
एक तिहाई मामले में, वहाँ दिलचस्प निष्कर्ष है कि कवक Phellorinia herculanea च के बीजाणुओं की एक निरीक्षण के बाद आया है। stellata च। नोवा (Agaricales) 31। साथ में बीजाणुओं के साथ, अप्रत्याशित नर्सरी कोशिकाओं का एक समूह SEM के तहत पहचान की थी। पिछले पारंपरिक प्रोटोकॉल और इलाज सामग्री के साथ, नर्स कोशिकाओं कहां आयाटी पूरी तरह से (चित्रा -1 सी) ढह गई। बीजाणुओं के लिए जुड़े विशेष ऊतकों के बारे में अधिक अनुमान मानक दृष्टिकोण यहाँ वर्णित (चित्रा -1) करने के लिए आसान है, लेकिन महत्वपूर्ण संशोधनों के साथ बनाया जा सकता है।
इस समीक्षा में, वहाँ विस्तृत SEM प्रोटोकॉल है कि में SEM अवलोकन के साथ जुड़े विभिन्न समस्याओं से निपटने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है वनस्पतियों, oomycetes, और इस तरह के सेल पतन और मेरिस्टेमेटिक ऊतक सिकुड़ते, पुटी कांटा के गैर इष्टतम विकास, और के विनाश के रूप Agaricales, अल्पकालिक ऊतकों, क्रमशः।
चित्रा 1: बिना (क, ग) और (बी, डी) प्रोटोकॉल एफएए-इथेनॉल सीपीडी इलाज के नमूने की तुलना। (एक – ख) Anacyclus clavatus, मध्य विकास के फूलों की कलियों। बड आज़मियम tetroxide 46 <के साथ इलाज/ sup> (क) और एफएए-सीपीडी प्रोटोकॉल (ख) के साथ इलाज कली। (ग – घ) के Phellorinia herculanea च बीजाणुओं के साथ नर्स कोशिकाओं। stellata। बिना किसी उपचार (ग) और प्रोटोकॉल यहाँ Agaricales (घ) के लिए वर्णित के साथ सूखे नमूने हैं। नारंगी में बीजाणुओं। तराजू: (एबी) 100 माइक्रोन, (सीडी) 50 माइक्रोन। Photos वाई रूज़-Leon द्वारा उठाए गए थे। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानक SEM प्रोटोकॉल के लिए सम्मान के साथ, यहाँ प्रस्तुत प्रक्रियाओं अपेक्षाकृत तेजी से पालन करने के लिए आसान है, और कम लागत के तरीके शामिल हैं। नमूने की राशि पर और प्रसंस्करण में आसानी पर निर्भर करता है, यह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना अनुदान समझौते सं 634429. इस प्रकाशन केवल लेखक के विचारों को प्रतिबिंबित करता है के तहत यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से धन प्राप्त हुआ है, और यूरोपीय आयोग जो जानकारी का बनाया जा सकता है किसी भी उपयोग के लिए जिम्मेदार नहीं ठहराया जा सकता उसमें निहित। हम यह भी असली Jardin Botanico, CSIC द्वारा की गई वित्तीय योगदान को स्वीकार करते हैं। एसआर Saprolegnia में उसे अनुसंधान के समर्थन के लिए यूरोपीय संघ [ITN-SAPRO-238550] करने के लिए आभारी है। हम भी फ्रांसिस्को Calonge धन्यवाद कृपया नमूने प्रोसेसिंग (चित्रा 5) के लिए Phellorinia herculanea छवियों और बी Pueyo प्रदान करना चाहते हैं। सभी छवियों मैड्रिड में रियल Jardin Botanico-CSIC पर SEM सेवा द्वारा उठाए गए थे।
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
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