Summary

Coleção de sérica e sem Alimentador rato-tronco embrionárias Médio condicionado celular para uma abordagem livre de celular

Published: January 08, 2017
doi:

Summary

Este protocolo proporciona um método para a recolha de células estaminais embrionárias de rato (MESC) forma climatizados, (MESC-CM) derivado de soro (soro fetal de bovino, FBS) – e do alimentador (fibroblastos embrionários de ratinho, MEFs) Livres de condições para uma célula abordagem -livre. Pode ser aplicável para o tratamento do envelhecimento e das doenças associadas ao envelhecimento.

Abstract

The capacity of embryonic stem cells (ESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs) to generate various cell types has opened new avenues in the field of regenerative medicine. However, despite their benefits, the tumorigenic potential of ESCs and iPSCs has long been a barrier for clinical applications. Interestingly, it has been shown that ESCs produce several soluble factors that can promote tissue regeneration and delay cellular aging, suggesting that ESCs and iPSCs can also be utilized as a cell-free intervention method. Therefore, the method for harvesting mouse embryonic stem cell (mESC)-conditioned medium (mESC-CM) with minimal contamination of serum components (fetal bovine serum, FBS) and feeder cells (mouse embryonic fibroblasts, MEFs) has been highly demanded. Here, the present study demonstrates an optimized method for the collection of mESC-CM under serum- and feeder-free conditions and for the characterization of mESC-CM using senescence-associated multiple readouts. This protocol will provide a method to collect pure mESC-specific secretory factors without serum and feeder contamination.

Introduction

O objetivo deste protocolo é recolher rato com células-tronco embrionárias (MESC) meio climatizados, (MESC-CM) a partir de condições de cultura sérica e livre de alimentação e caracterizar suas funções biológicas.

Em geral, as células-tronco embrionárias (CES) têm um grande potencial para a medicina regenerativa e terapia celular, devido à sua pluripotência e capacidade de auto-renovação 1-3. No entanto, o transplante de células-tronco directa tem várias limitações, tais como a rejeição imunológica e a formação do tumor 4,5. Portanto, uma abordagem livre de células pode fornecer uma estratégia terapêutica alternativa para a medicina regenerativa e envelhecimento intervenções 6,7.

A senescência é visto como um homólogo celular para o envelhecimento dos tecidos e órgãos, caracterizado por um estado permanente de paragem do crescimento, fisiologia celular alterada, e comportamentos. O envelhecimento é o principal fator de risco para doenças prevalentes, incluindo cancro, doenças cardiovasculares, tYpê 2 diabetes e neurodegeneração 8. Uma das características óbvias de envelhecimento é o declínio no potencial regenerativo dos tecidos, que é causada pelo envelhecimento de células-tronco e exaustão 9. Muitos estudos têm demonstrado significativas moléculas farmacológicas, tais como a rapamicina 9, o resveratrol 10, 11 e metformina, e factores sistémicos transmitidas pelo sangue, a saber, GDF11 12, que tem a capacidade de atrasar o envelhecimento de forma consistente e estender a esperança de vida.

No presente estudo, MESC-CM foi colhida sem soro camadas (soro fetal bovino, FBS) e alimentação (rato embrionárias fibroblastos, MEFs) para excluir a contaminação de fatores séricos e factores de secreção de MEFs. Estas condições permitidas para uma CM sérica e livre de alimentador que, consequentemente, permitiu a identificação precisa dos fatores de secreção MESC específicas do.

Este protocolo proposto é altamente eficiente, de custo relativamente eficaz e fácilpara operar. Esta técnica proporciona perspectivas sobre a caracterização de factores solúveis MESC-derivados que podem mediar um efeito anti-senescência, que pode ser utilizada para o desenvolvimento de uma abordagem terapêutica isento de células segura e potencialmente vantajoso para intervenções para as doenças do envelhecimento-associados e de outros regenerativa tratamentos.

Protocol

NOTA: Um esquema do protocolo de recolha sérica e CM isento de alimentador é mostrado na Figura 1. 1. Materiais (Preparação de MEFs, Medium, pratos e Soluções) Preparar 500 ml de meio de cultura para os MEFs. Suplemento Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de FBS (qualidade CES), 50 unidades / ml de penicilina, e 50 mg / ml de estreptomicina. Isolar MEFs de embriões seguindo um protocolo de rotina estabelecida 13 e mantê-los em meio MEF. </…

Representative Results

Originalmente, mESCs são mantidos em um alimentador MEF em meio com FBS a MESC e outros suplementos (Figuras 1A e 2A). CM foi recolhido a partir de mESCs na redução meio de soro, sem uma camada de alimentação, de FBS, ou outros suplementos (Figuras 1B e 2B). Esta condição cultura nos permite coletar específico do MESC meio condicionado sem potencial contaminação pelos fatores do alimentador, FBS, ou outros supl…

Discussion

Para a recolha bem sucedida de sérica e MESC-CM sem alimentador, as seguintes sugestões devem ser levados em consideração. O fator mais crítico é usando mESCs passagem precoce para a recolha de MESC-CM. Anteriormente, demonstrou-se que no início passagem MESC-CM tem melhores efeitos anti-envelhecimento em comparação com mESCs passagem final. O número passagem do mESCs tem sido relatada a afectar o seu potencial de desenvolvimento 16 e pluripotência 17.

Embora…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa Ciência Básica Pesquisa (2013R1A1A2060930) e do Programa do Centro de Investigação Médica (2015R1A5A2009124) através da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e planejamento futuro. Esta pesquisa também é apoiado por uma subvenção de funcionamento Start-up do Hospital for Sick Children (HK Sung). Nós gostaríamos de agradecer a Laura Barwell e Sarah JS Kim por sua excelente ajuda na edição deste manuscrito e Dr. Andras Nagy para fornecer a linha G4 MESC.

Materials

DMEM Invitrogen #11960-044
FBS Invitrogen #30044333 20%, ES cell quality
Penicillin and streptomycin  Invitrogen #15140 50units/ml penicillin and 50mg/ml strepto
-mycin.
L-glutamine  Invitrogen #25030 2mM
Nonessential amino acids (NEAA)  Invitrogen #11140 100uM
β-mercaptoethanol  Sigma #M3148 100uM
Leukemia inhibitory factor  Millipore #ESG1107 100units/ml
OPTI-MEM Invitrogen #22600
X-gal  Sigma #B4252 1mg/ml
Paraformaldehyde (PFA) Sigma P6148 3.70%
Dimethylformamide (DMF) Sigma #D4551
Potassium ferricyanide  Aldrich #455946 5mM
potassium ferrocyanide  Aldrich #455989 5mM
NaCl  Sigma #S7653 150mM
MgCl Sigma #M2393 2mM
Mytomycin C  Sigma #M4287 10ug/ml
Propidium iodide  Sigma #P4170 50ug/ml
TRIzol Ambion #15596018
M-MLV reverse transcript-tase Promega #M170B
Power SYBR Green PCR master mix  Applied Biosystems #4367659
HDFs, NHDF-Ad-Der-Fibroblast  LONZA #CC-2511
Bottle top filter,  Corning #430513 0.2μm

References

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  2. Lavasani, M., et al. Muscle-derived stem/progenitor cell dysfunction limits healthspan and lifespan in a murine progeria model. Nat Commun. 3, 608 (2012).
  3. Woo, D. H., et al. Direct and indirect contribution of human embryonic stem cell-derived hepatocyte-like cells to liver repair in mice. Gastroenterology. 142, 602-611 (2012).
  4. Lee, A. S., Tang, C., Rao, M. S., Weissman, I. L., Wu, J. C. Tumorigenicity as a clinical hurdle for pluripotent stem cell therapies. Nat Med. 19, 998-1004 (2013).
  5. Moon, S. H., et al. A system for treating ischemic disease using human embryonic stem cell-derived endothelial cells without direct incorporation. Biomaterials. 32, 6445-6455 (2011).
  6. Tongers, J., Roncalli, J. G., Losordo, D. W. Therapeutic angiogenesis for critical limb ischemia: microvascular therapies coming of age. Circulation. 118, 9-16 (2008).
  7. Lazarous, D. F., et al. Basic fibroblast growth factor in patients with intermittent claudication: results of a phase I trial. J Am Coll Cardiol. 36, 1239-1244 (2000).
  8. Adams, P. D. Healing and hurting: molecular mechanisms, functions, and pathologies of cellular senescence. Mol Cell. 36, 2-14 (2009).
  9. Harrison, D. E., et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice. Nature. 460, 392-395 (2009).
  10. Baur, J. A., Ungvari, Z., Minor, R. K., Le Couteur, D. G., de Cabo, R. Are sirtuins viable targets for improving healthspan and lifespan. Nat Rev Drug Discov. 11, 443-461 (2012).
  11. Martin-Montalvo, A., et al. Metformin improves healthspan and lifespan in mice. Nat Commun. 4, 2192 (2013).
  12. Loffredo, F. S., et al. Growth differentiation factor 11 is a circulating factor that reverses age-related cardiac hypertrophy. Cell. 153, 828-839 (2013).
  13. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. , (2012).
  14. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4, 1798-1806 (2009).
  15. Bae, Y. U., Choi, J. H., Nagy, A., Sung, H. K., Kim, J. R. Antisenescence effect of mouse embryonic stem cell conditioned medium through a PDGF/FGF pathway. FASEB J. 30, 1276-1286 (2016).
  16. Nagy, A., Rossant, J., Nagy, R., Abramow-Newerly, W., Roder, J. C. Derivation of completely cell culture-derived mice from early-passage embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 8424-8428 (1993).
  17. Li, X. Y., et al. Passage number affects the pluripotency of mouse embryonic stem cells as judged by tetraploid embryo aggregation. Cell Tissue Res. 327, 607-614 (2007).
  18. Mbeunkui, F., Fodstad, O., Pannell, L. K. Secretory protein enrichment and analysis: an optimized approach applied on cancer cell lines using 2D LC-MS/MS. J Proteome Res. 5, 899-906 (2006).
  19. Makridakis, M., Vlahou, A. Secretome proteomics for discovery of cancer biomarkers. J Proteomics. 73, 2291-2305 (2010).
  20. Kim, K. S., et al. Regulation of replicative senescence by insulin-like growth factor-binding protein 3 in human umbilical vein endothelial cells. Aging Cell. 6, 535-545 (2007).
  21. Kim, K. S., et al. Induction of cellular senescence by insulin-like growth factor binding protein-5 through a p53-dependent mechanism. Mol Biol Cell. 18, 4543-4552 (2007).
  22. Eiselleova, L., et al. Comparative study of mouse and human feeder cells for human embryonic stem cells. Int J Dev Biol. 52, 353-363 (2008).

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Cite This Article
Bae, Y., Sung, H., Kim, J. Collection of Serum- and Feeder-free Mouse Embryonic Stem Cell-conditioned Medium for a Cell-free Approach. J. Vis. Exp. (119), e55035, doi:10.3791/55035 (2017).

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