Summary

Methodik für die Studie des horizontalen Gentransfers in<em> Staphylococcus aureus</em

Published: March 10, 2017
doi:

Summary

Wir beschreiben hier drei verschiedene Protokolle für die in vitro Untersuchung der Konjugation, Transduktion, Transformation und natürliche in Staphylococcus aureus.

Abstract

Ein wichtiges Merkmal der wichtigsten opportunistischen Humanpathogen Staphylococcus aureus ist seine außerordentliche Fähigkeit, schnell eine Resistenz gegen Antibiotika zu erwerben. Genomic Studien zeigen , daß S. aureus trägt viele Virulenz und Resistenzgene in mobilen genetischen Elementen befindet, was darauf hindeutet , dass der horizontale Gentransfer (HGT) spielt eine kritische Rolle in S. aureus Evolution. Jedoch eine vollständige und detaillierte Beschreibung der Methode zu untersuchen HGT in S. aureus verwendet noch fehlt, insbesondere in Bezug auf natürliche Transformation, die in diesem Bakterium kürzlich berichtet wurde. Diese Arbeit beschreibt drei Protokolle , die für die in vitro Untersuchung der HGT in S. aureus geeignet sind , Konjugation, Phagentransduktion und natürliche Transformation. Zu diesem Zweck das cfr – Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand), die die Phenicolen verleiht, Lincosamides, Oxazolidinone, Pleuromutilinen und Streptogramin A (PhLOPSA) -Widerstand Phänotyp, verwendet wurde. Die Mechanismen , durch die S. aureus genetischen Materialien auf andere Stämme über zu verstehen ist wesentlich , um die schnelle Erfassung des Widerstands Begreifen und hilft , die Arten der Verbreitung berichtet in Überwachungsprogrammen oder zur weiteren Vorhersage der Ausbreitung Modus in der Zukunft zu klären.

Introduction

Staphylococcus aureus ist ein symbiotischer Gram-positive Bakterien, die die Haut und Nasenhöhle von Menschen und Tieren natürlich bewohnt. Diese Bakterienarten ist die häufigste Ursache von nosokomialen Infektionen in Krankenhäusern und medizinischen Einrichtungen. Darüber hinaus seine Fähigkeit, Widerstand gegen verschiedene antimikrobielle Verbindungen zu entwickeln, hat die Verwaltung der Infektionen durch dieses Bakterium in eine globale Besorgnis hervorgerufen hat.

Zwei Hauptwege, die an der Verbreitung der Resistenz-Phänotypen sind bekannt: die klonale Verbreitung von resistenten Genotypen und die Verbreitung von genetischen Determinanten unter den bakteriellen Pool. Im Fall von S. aureus, verschiedene antibiotische Resistenzgene (sowie Virulenzdeterminanten) wurden gefunden mit mobilen genetischen Elementen (MGEs) 1 zugeordnet werden. Das Vorhandensein dieser Elemente in das Genom von S. aureus zeigt , dass die Übernahme und Übergabe von Genetic Material innerhalb der Bakterienpopulation könnte eine wichtige Rolle für S. aureus Anpassung und Entwicklung spielen.

Transformation, Konjugation und Transduktion Phage: genetisches Material kann durch drei bekannte Mechanismen der HGT in Gram-positive Bakterien ausgetauscht werden. Transformation beinhaltet die Aufnahme von freier DNA. Zum Erwerb von Fremd-DNA, müssen Bakterienzellen eine besondere physiologische Phase zu entwickeln: die Kompetenz der Bühne. Wenn dieses Stadium erreicht ist, werden kompetente Zellen, die DNA in das Cytoplasma transportieren, neue genetische Determinanten erwerben. Im Fall von S. aureus, die Existenz von natürlichen Transformation kürzlich 2 nachgewiesen wurde. Im Einklang damit hat unsere Gruppe Licht auf die Relevanz der Expression des Seufzen Faktor Schuppen (ein kryptischer Faktor sekundäre Transkription Sigma) in der Kompetenz Stufe der Entwicklung und darüber , wie seine konstitutive Expression S. aureus von reachin fähig machtg die Kompetenz Stufe, die 2 für den Erwerb von resistenten Phänotypen durch natürliche Transformation ermöglicht.

Konjugation ist ein Prozess, der die Übertragung von DNA aus einer lebenden Zelle (Spender) zu einem anderen (Empfänger). Beide Zellen müssen in direktem Kontakt sein, so dass die DNA ausgetauscht werden, während sie durch spezielle Strukturen geschützt werden, wie beispielsweise Rohre oder Poren. Der Transfer von DNA durch dieses Verfahren erfordert die konjugativen Maschinen. In S. aureus, ist der Prototyp konjugativen Plasmids PGO1, die den konjugativen Operon TraA 3 beherbergt.

Phagentransduktion beinhaltet den Transfer von DNA von Zelle zu Zelle durch Bakteriophageninfektion und impliziert die Verpackung von bakterieller DNA, viraler DNA statt, in die Phagen-Capsid. Die meisten von S. aureus – Isolate werden von Bakteriophagen 1 lysogeniert. Bei Stressbedingungen kann Prophagen aus dem bakteriellen Genom herausgeschnitten werdene und Schalten in den lytischen Zyklus.

Dies sind die drei bekannten Mechanismen für die DNA Übertragung in S. aureus. Es gibt einige zusätzliche Transfermechanismen, beispielsweise "pseudo-Transformation" 2 und Phagen-ähnlichen Systemen in der Übertragung von Pathogenitätsinseln 4. Vor kurzem berichteten eine Gruppe , dass "Nanoröhren" bei der Übertragung von zellulären Materialien beteiligt sind (einschließlich Plasmid – DNA) zwischen benachbarten Zellen 5, 6, aber ein Follow-up – Studie wurde von anderen Gruppen bisher nicht erschienen.

Diese Arbeit stellt die notwendige Methodik HGT in S. aureus zu studieren , indem sie die drei wichtigsten Übertragungswege Adressierung Konjugation, Transduktion und natürliche Transformation. Die Ergebnisse mit diesen Methoden gewonnen wurden verwendet , um die Übertragung des cfr – Gen (Chloramphenicol / Florfenicol Widerstand) zu studieren , unterS. aureus – Stämme 7. Diese drei Techniken sind vielseitige Werkzeuge für die Untersuchung von MGE Übertragung in S. aureus.

Protocol

HINWEIS: Die Stämme und Materialien , die in dieser Arbeit sind in Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien aufgeführt sind. In den Übertragungsversuchen, N315 und COL cfr -positiver Derivate wurden als Spender des GRR – Gens (N315-45 und COL-45) verwendet. Diese Stämme wurden zuvor durch Konjugation erhalten, wobei als Spender einer klinischen cfr -positiver Staphylococcus epidermidis – Stamm (ST2), im Anschluss an die Standard – Konjugation Pro…

Representative Results

Die hier dargestellten Ergebnisse wurden bereits veröffentlicht (aus Referenz 7 mit Zustimmung des Herausgebers angepasst). Wir untersuchten die möglichen Übertragungswege des GRR – Gen, das Linezolid Widerstand mit niedrigem Pegel bewirkt , und die Expression des PhLOPSA-Resistenz – Phänotyp 14, 15 in S. aureus – Stämme, durch drei Mechanismen der HGT zu untersuchen. <p class="j…

Discussion

Diese Arbeit beschreibt die drei wichtigsten Methoden , um die HGT genetischen Determinanten im S. aureus zu studieren. Obwohl Transduktion und Konjugation seit Jahrzehnten untersucht wurde, wurde die Existenz der natürlichen Transformation erst vor kurzem 2 anerkannt. Somit ist S. aureus mit allen drei großen ausgestattet Modi von HGT und Testen alle von ihnen benötigt wird , um die mögliche Verbreitung Wege von genetischen Determinanten zu klären. Das Ziel dieser Ar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).

Materials

Tryptic Soy Broth (TSB)  Becton Dickinson  211825
Brain Heart Infusion (BHI) Becton Dickinson  211059
Nutrient Broth No. 2 Oxoid CM0067
Sheep blood agar Eiken Chemical Co.,Ltd. E-MR96 Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. 
Agar powder Wako Pure Chemical Industries 010-08725
Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) Wako Pure Chemical Industries 191-01785
Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter Merck Milipore HAWG 02500
QIAfilter Plasmid Midi kit QIAGEN 12243

References

  1. Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
  2. Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
  3. Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
  4. Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
  5. Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
  6. Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
  7. Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
  8. Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
  9. Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
  10. Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
  11. Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
  12. Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
  13. Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
  14. Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
  15. Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
  16. Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
  17. Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
  18. McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
  19. Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
  20. Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
check_url/kr/55087?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Cafini, F., Thi Le Thuy, N., Román, F., Prieto, J., Dubrac, S., Msadek, T., Morikawa, K. Methodology for the Study of Horizontal Gene Transfer in Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (121), e55087, doi:10.3791/55087 (2017).

View Video