Metodik för studier av horisontell genöverföring i<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Vi beskriver här tre olika protokoll för undersökning in vitro av konjugation, transduktion, och naturlig transformation i Staphylococcus aureus.
Abstract
En viktig egenskap hos den huvudsakliga opportunistiska human patogen Staphylococcus aureus är dess extraordinära förmåga att snabbt erhålla resistens mot antibiotika. Iska studier visar att S. aureus bär många virulens och resistensgener som finns i mobila genetiska element, vilket tyder på att horisontell genöverföring (HGT) spelar en avgörande roll i S. aureus evolution. Men en fullständig och detaljerad beskrivning av den metod som används för att studera HGT i S. aureus saknas fortfarande, särskilt när det gäller naturlig transformation, som nyligen har rapporterats i denna bakterie. Detta arbete beskriver tre protokoll som är användbara för in vitro undersökning av HGT i S. aureus konjugation, fagtransduktion och naturlig transformation. För detta ändamål, CFR-genen (kloramfenikol / florfenikol motstånd), vilket ger de fenikoler, Linkosamider, oxazolidinoner, pleuromutiliner, och streptogramin A (PhLOPSA) resistensgen fenotyp, användes. Att förstå de mekanismer genom vilka S. aureus överför genetiskt material till andra stammar är viktigt att förstå den snabba förvärv av motstånd och hjälper till att klargöra lägen för spridning redovisas i övervakningsprogram eller ytterligare förutsäga spridningsmoden i framtiden.
Introduction
Staphylococcus aureus är en kommensala grampositiv bakterie som naturligt bebor huden och näshålan hos människor och djur. Denna bakteriearter är den vanligaste orsaken till nosokomiala infektioner i sjukhus och vårdmiljöer. Dessutom har dess förmåga att utveckla resistens mot olika antimikrobiella föreningar gjorde förvaltning av infektioner orsakade av denna bakterie i en global angelägenhet.
Två huvudvägar som är involverade i spridningen av motstånds fenotyper är kända: den klonala spridningen av resistenta genotyper och spridning av genetiska faktorer bland bakterie poolen. I fallet med S. aureus, olika antibiotikaresistensgener (liksom virulensdeterminanter) har befunnits vara associerade med mobila genetiska element (MGEs) 1. Förekomsten av dessa element i genomet hos S. aureus indikerar att förvärv och överlåtelse av genetic material inuti bakteriepopulation skulle kunna spela en viktig roll för S. aureus anpassning och evolution.
Genetiskt material kan bytas genom tre välkända mekanismer för HGT i grampositiva bakterier: transformation, konjugation och fagtransduktion. Transformation innebär upptag av fritt DNA. Att förvärva främmande DNA, bakterieceller behöver utveckla en speciell fysiologisk fas: kompetensstadiet. När detta steg har nåtts, kompetenta celler har förmåga att transportera DNA in i cytoplasman, förvärva nya genetiska determinanter. I fallet med S. aureus, har förekomsten av naturlig transformation nyligen demonstrerats 2. I linje med detta har vår grupp belysa betydelsen av uttrycket av Suck faktorn (ett kryptiskt sekundär transkriptions sigma faktor) i kompetensutvecklingsstadium och om hur dess konstitutivt uttryck gör S. aureus kan reaching kompetensstadiet, vilket gör det möjligt för förvärv av resistenta fenotyper genom naturlig transformation 2.
Konjugering är en process som involverar överföring av DNA från en levande cell (donator) till en annan (mottagaren). Båda cellerna måste vara i direkt kontakt, så att det DNA som skall utbytas under det att den skyddas av särskilda strukturer, såsom rör eller porer. Överföring av DNA genom denna metod kräver den konjugativ maskiner. I S. aureus, är prototypen konjugativa plasmiden PGO1, som härbärgerar konjugativ operon Traa 3.
Fagtransduktion innebär överföring av DNA från cell till cell genom bakteriofag infektion och innebär förpackning av bakterie-DNA, i stället för viralt DNA, in i fag-kapsiden. De flesta av S. aureus isolat lysogenized av bakteriofager 1. Vid stressförhållanden, kan profager skäras ut från den bakteriella GENOMe och övergång till den lytiska cykeln.
Dessa är de tre väl kända mekanismer för DNA-överföring i S. aureus. Det finns några ytterligare överföringsmekanismer, såsom "pseudo-transformation" 2 och fag-liknande system i överföringen av patogenicitet öar 4. Nyligen en grupp rapporterade att "nanorör" är involverade i överföringen av cellulära material (inklusive plasmid DNA) mellan angränsande celler 5, 6, men en uppföljningsstudie har inte framgått av andra grupper hittills.
Detta arbete ger den nödvändiga metoden för att studera HGT i S. aureus ta itu med de tre viktigaste överföringsvägar konjugation, transduktion, och naturlig omvandling. De erhållna resultaten med dessa metoder användes för att studera överföringen av den gemensamma referensramen genen (kloramfenikol / florfenikol motstånd) blandS. aureus stammar 7. Dessa tre tekniker är mångsidiga verktyg för undersökning av MGE överföring i S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta arbete beskriver de tre stora metoder för att studera HGT av genetiska faktorer i S. aureus. Även överföring och konjugation har studerats i årtionden, förekomsten av naturliga transformation bara nyligen erkänts 2. Således är S. aureus utrustad med alla de tre stora typer av HGT och testa dem krävs för att klargöra de eventuella spridningsvägar genetiska faktorer. Syftet med detta arbete är att sammanställa fullständiga protokoll och ge praktisk info…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
References
- Lindsay, J. A. Genomic variation and evolution of Staphylococcus aureus. IJMM. 300, 98-103 (2010).
- Morikawa, K., et al. Expression of a cryptic secondary sigma factor gene unveils natural competence for DNA transformation in Staphylococcus aureus. PLoS Pathog. 8, e1003003 (2012).
- Caryl, J. A., O’Neill, A. J. Complete nucleotide sequence of pGO1, the prototype conjugative plasmid from the Staphylococci. Plasmid. 62, 35-38 (2009).
- Novick, R. P., Christie, G. E., Penades, J. R. The phage-related chromosomal islands of Gram-positive bacteria. Nat. Rev. Microbiol. 8, 541-551 (2010).
- Dubey, G. P., Ben-Yehuda, S. Intercellular nanotubes mediate bacterial communication. Cell. 144, 590-600 (2011).
- Dubey, G. P., et al. Architecture and Characteristics of Bacterial Nanotubes. Dev cell. 36, 453-461 (2016).
- Cafini, F., et al. Horizontal gene transmission of the cfr gene to MRSA and Enterococcus: role of Staphylococcus epidermidis as a reservoir and alternative pathway for the spread of linezolid resistance. J. Antimicrob. Chemother. 71, 587-592 (2016).
- Dyke, K. G., Jevons, M. P., Parker, M. T. Penicillinase production and intrinsic resistance to penicillins in Staphylococcus aures. Lancet. 1, 835-838 (1966).
- Kuroda, M., et al. Whole genome sequencing of meticillin-resistant Staphylococcus aureus. Lancet. 357, 1225-1240 (2001).
- Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA. Science. 322, 1843-1845 (2008).
- Clinical Laboratory Standards Institute. . Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Growth Aerobically – Seventh Edition: Approved Standard M7-A7. , (2006).
- Edwards, R. A., Helm, R. A., Maloy, S. R. Increasing DNA transfer efficiency by temporary inactivation of host restriction. BioTechniques. 26, 892-894 (1999).
- Thi, L. T., Romero, V. M., Morikawa, K. Cell wall-affecting antibiotics modulate natural transformation in SigH-expressing Staphylococcus aureus. J. Antibiot. , (2015).
- Long, K. S., Poehlsgaard, J., Kehrenberg, C., Schwarz, S., Vester, B. The Cfr rRNA methyltransferase confers resistance to Phenicols, Lincosamides, Oxazolidinones, Pleuromutilins, and Streptogramin A antibiotics. Antimicrob. Agents Chemother. 50, 2500-2505 (2006).
- Ando, T., et al. Restriction-modification system differences in Helicobacter pylori are a barrier to interstrain plasmid transfer. Mol microbiol. 37, 1052-1065 (2000).
- Evans, B. A., Rozen, D. E. Significant variation in transformation frequency in Streptococcus pneumoniae. ISME J. 7, 791-799 (2013).
- Wilson, D. L., et al. Variation of the natural transformation frequency of Campylobacter jejuni in liquid shake culture. Microbiology. 149, 3603-3615 (2003).
- McCarthy, A. J., Witney, A. A., Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus temperate bacteriophage: carriage and horizontal gene transfer is lineage associated. Front Cell Infect Microbiol. 2, 6 (2012).
- Lindsay, J. A. Staphylococcus aureus genomics and the impact of horizontal gene transfer. IJMM. 304, 103-109 (2014).
- Uchiyama, J., et al. Intragenus generalized transduction in Staphylococcus spp. by a novel giant phage. ISME J. 8, 1949-1952 (2014).
