Metodologia per lo studio del orizzontale Gene Transfer in<em> Staphylococcus aureus</em
Summary
Descriviamo qui tre protocolli diversi per la ricerca in vitro di coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale in Staphylococcus aureus.
Abstract
Una caratteristica importante dei principali patogeni umani opportunista Staphylococcus aureus è la sua straordinaria capacità di acquisire rapidamente la resistenza agli antibiotici. Studi di genomica rivelano che S. aureus porta molti geni di virulenza e di resistenza si trovano in elementi genetici mobili, suggerendo che il trasferimento genico orizzontale (HGT) svolge un ruolo critico in S. aureus evoluzione. Tuttavia, una descrizione completa e dettagliata della metodologia utilizzata per lo studio HGT in S. aureus è ancora carente, soprattutto per quanto riguarda la trasformazione naturale, che è stato recentemente riportato in questo batterio. Questo lavoro descrive tre protocolli che sono utili per le indagini in vitro di HGT in S. aureus: coniugazione, trasduzione dei fagi, e trasformazione naturale. A questo scopo, il gene CFR (cloramfenicolo / resistenza florfenicolo), che conferisce le fenicoli, Lincosamidi, oxazolidinoni, pleuromutiline, e streptogramine A (PhLOPSA) -Resistenza fenotipo, è stato utilizzato. La comprensione dei meccanismi attraverso i quali S. aureus trasferisce materiale genetico ad altri ceppi è essenziale per comprendere la rapida acquisizione di resistenza e aiuta a chiarire le modalità di diffusione riportati in programmi di sorveglianza o per prevedere ulteriormente la modalità di diffusione in futuro.
Introduction
Staphylococcus aureus è un batterio Gram-positivi commensale che abita naturalmente la cavità nasale e la pelle degli esseri umani e degli animali. Questa specie batterica è la principale causa di infezioni nosocomiali negli ospedali e case di cura. Inoltre, la sua capacità di sviluppare resistenza a diversi composti antimicrobici ha reso la gestione delle infezioni causate da questo batterio in un problema globale.
Due vie principali coinvolti nella diffusione di fenotipi di resistenza sono noti: la diffusione clonale di genotipi resistenti e la diffusione dei determinanti genetici tra la piscina batterica. Nel caso di S. aureus, diversi geni di resistenza agli antibiotici (così come determinanti di virulenza) sono stati trovati per essere associate a elementi genetici mobili (MGEs) 1. La presenza di questi elementi nel genoma di S. aureus indica che l'acquisizione e il trasferimento di genmateriale etico all'interno della popolazione batterica potrebbe svolgere un ruolo importante per S. aureus l'adattamento e l'evoluzione.
Il materiale genetico può essere scambiato attraverso tre meccanismi ben noti di HGT nei batteri Gram-positivi: trasformazione, coniugazione, e fago trasduzione. La trasformazione comporta l'assorbimento del DNA libero. Per acquisire DNA estraneo, le cellule batteriche devono sviluppare una speciale fase fisiologica: la fase di competenza. Quando viene raggiunto questo stadio, le cellule competenti sono in grado di trasportare DNA nel citoplasma, acquisire nuovi determinanti genetici. Nel caso di S. aureus, l'esistenza di trasformazione naturale è stato recentemente dimostrato 2. In linea con questo, il nostro gruppo ha messo in luce l'importanza dell'espressione del fattore Sigh (un criptico trascrizione secondario fattore sigma) in fase di competenze di sviluppo e su come la sua espressione costitutiva rende S. aureus in grado di reaching la fase di competenza, che consente l'acquisizione di fenotipi resistenti da trasformazione naturale 2.
La coniugazione è un processo che comporta la trasmissione di DNA da una cellula vivente (donatore) ad un altro (ricevente). Entrambe le cellule devono essere a contatto diretto, permettendo il DNA da scambiare essendo protetto da strutture speciali, come tubi o pori. Il trasferimento di DNA da questo metodo richiede la macchina conjugative. In S. aureus, il plasmide prototipo conjugative è PGO1, che ospita il conjugative operone Traa 3.
Phage trasduzione comporta il trasferimento di DNA da cellula a cellula attraverso l'infezione batteriofago ed implica il confezionamento di DNA batterico, invece di DNA virale, nel capside fagico. La maggior parte degli isolati di S. aureus sono lysogenized dai batteriofagi 1. Al condizioni di stress, profagi possono essere asportati dal genom battericaee passaggio al ciclo litico.
Questi sono i tre meccanismi ben noti per la trasmissione DNA in S. aureus. Ci sono alcuni meccanismi di trasferimento aggiuntivi, come "pseudo-trasformazione" 2 e sistemi fago come nel trasferimento delle isole di patogenicità 4. Recentemente, un gruppo riferito che "nanotubi" sono coinvolte nel trasferimento di materiali cellulari (compreso il DNA plasmidico) tra cellule adiacenti 5, 6, ma un studio di follow-up non è apparsa altri gruppi finora.
Questo lavoro fornisce la metodologia necessario studiare HGT in S. aureus affrontando le tre principali vie di trasferimento: coniugazione, trasduzione e trasformazione naturale. I risultati ottenuti con queste metodologie sono stati usati per studiare la trasmissione del gene cfr (cloramfenicolo / resistenza Florfenicolo) traS. aureus ceppi 7. Queste tre tecniche sono strumenti versatili per l'indagine della trasmissione MGE in S. aureus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo lavoro descrive i tre metodi principali per studiare la HGT di determinanti genetici di S. aureus. Anche se trasduzione e coniugazione sono stati studiati per decenni, l'esistenza di trasformazione naturale è stata solo di recente riconosciuta 2. Così, S. aureus è dotato di tutti i tre principali modalità di HGT, e testare tutti loro è necessario per chiarire le possibili vie di diffusione dei determinanti genetici. Lo scopo di questo lavoro è quello di co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was partly supported by Takeda Science Foundation, Pfizer Academic Contribution and JSPS Postdoctoral Fellowship for Foreign Researchers (FC).
Materials
| Tryptic Soy Broth (TSB) | Becton Dickinson | 211825 | |
| Brain Heart Infusion (BHI) | Becton Dickinson | 211059 | |
| Nutrient Broth No. 2 | Oxoid | CM0067 | |
| Sheep blood agar | Eiken Chemical Co.,Ltd. | E-MR96 | Tryptic soy agar added with 5% (v/v) sheep blood according to the manufacturer. |
| Agar powder | Wako Pure Chemical Industries | 010-08725 | |
| Sodium citrate (Trisodium citrate dihydrate) | Wako Pure Chemical Industries | 191-01785 | |
| Cellulose Ester Gridded 0.45 μL HAWG filter | Merck Milipore | HAWG 02500 | |
| QIAfilter Plasmid Midi kit | QIAGEN | 12243 |
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