Monitoramento de Astrocyte de reatividade e proliferação in Vitro sob condições isquêmicas

Summary

Acidente vascular cerebral isquêmico é um evento complexo, no qual a contribuição específica dos astrócitos à região afetada do cérebro exposto a privação de oxigênio glicose (OGH) é difícil de estudar. Este artigo apresenta uma metodologia para obter isolados astrócitos e estudar sua reatividade e proliferação em condições OGH.

Abstract

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão complexa do cérebro causada por um trombo ou êmbolo obstruindo o fluxo sanguíneo para partes do cérebro. Isto leva à privação de oxigênio e glicose, o que faz com que a falha de energia e morte neuronal. Depois de um insulto isquêmico, astrócitos tornar-se reativa e proliferam em torno do local da lesão, como ela se desenvolve. Sob esse cenário, é difícil estudar a contribuição específica dos astrócitos, a região do cérebro exposto à isquemia. Portanto, este artigo apresenta uma metodologia para estudar a reatividade astrocyte primária e proliferação sob um modelo in vitro de um ambiente, como isquemia, chamado de privação de oxigênio glicose (OGH). Astrócitos foram isolados a partir de dia 1-4-velhos ratos Neonatais e o número de células hamartomas específico foi avaliada utilizando marcador seletivo de astrocyte gliais de proteína ácida fibrilar (GFAP) e coloração nuclear. O período em que astrócitos estão sujeitos à condição de OGH pode ser personalizado, bem como a percentagem de oxigênio que estão expostos. Essa flexibilidade permite aos cientistas caracterizar a duração do estado isquêmico, como em diferentes grupos de células in vitro. Este artigo discute os prazos de OGH que induzem a reatividade astrocyte, morfologia hipertrófica e proliferação, como medido por imunofluorescência usando Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA). Além de proliferação, astrócitos passam por energia e estresse oxidativo e respondem a OGH pela liberação de fatores solúveis no meio de célula. Este meio pode ser coletado e utilizado para analisar os efeitos das moléculas lançados por astrócitos em culturas neuronal preliminares sem interação célula a célula. Em resumo, este modelo de cultura celular primária pode ser usado com eficiência para entender o papel dos astrócitos isolados após lesão.

Introduction

Traço é definido como “uma aguda disfunção neurológica de origem vascular com súbito ou rápido desenvolvimento de sintomas e sinais, correspondentes à participação de áreas focais no cérebro”^1,2. Existem dois tipos de AVC: isquêmico e hemorrágico. Quando a disfunção vascular é causada por um aneurisma ou uma avaria arteriovenosa, acompanhado pelo enfraquecimento com posterior ruptura de uma artéria, este é denominado acidente vascular cerebral hemorrágico³ que, na maioria dos casos, leva à morte. Quando um trombo ou um êmbolo obstrui o fluxo sanguíneo, causando uma temporária privação de oxigênio e glicose para uma região do cérebro, é chamado de acidente vascular cerebral isquêmico⁴. Falha para nutrir as células ao redor da área afetada ou núcleo isquêmico leva a um desequilíbrio homeostático e metabólico, disfunção energética, morte neuronal e inflamação⁵, que pode induzir a uma deficiência ao longo da vida para pacientes⁶.

Acidente vascular cerebral isquêmico é uma lesão multifatorial, envolvendo vários tipos de células que reagem e exercem seus efeitos nos pontos de tempo diferentes. Muitas interações criam um ambiente difícil para estudar o comportamento de células individuais. Então, como é que estudamos o contributo de um tipo de célula específica em um ambiente tão complexo? Um modelo aceito em vitro de isquemia consiste em expor as células à privação de oxigênio e glicose (OGH), durante um determinado período, seguido da restauração das células para um ambiente normoxic. Este sistema simula um acidente vascular cerebral isquêmico seguido de reperfusão de sangue. Neste método, as células ou tecidos são expostos a uma mídia livre de glicose em um ambiente purificado de oxigênio, utilizando uma câmara especializada hipóxica. O tempo de incubação OGH pode variar de alguns minutos até 24 h, dependendo da hipótese de que quer ser testado. Estudos têm mostrado que, dependendo da época do OGH e normoxic ambiente, fenótipos específicos do curso (ou seja, aguda ou subcrónica) pode ser alcançado. Primários isolados astrócitos, expostos a OGH com posterior restauração às condições normoxic, é um modelo de celular bem estudado para imitar o traço in-vitro⁷. Usando OGH é possível revelar os mecanismos moleculares independentes de células isoladas em um ambiente semelhante ao curso.

À medida que aumenta nosso conhecimento da biologia de astrocyte, tornou-se evidente que eles são cruciais para manter as sinapses e sustentar de reparação, desenvolvimento e plasticidade neural⁸. Em condições normais, astrócitos liberar e respondem às citocinas, quimiocinas, factores de crescimento e gliotransmitters, mantendo o equilíbrio metabólico e homeostase dentro sinapses^5,9. Em neuroinflammation aguda, tais como acidente vascular cerebral isquêmico, estas células podem tornar-se reativa, mostrar uma superexpressão de longo prazo de Glial fibrilar ácida proteína (GFAP) e mostrar hipertrofia em sua morfologia^{5,10, 11 , 12}. como o infarto isquêmico se desenvolve, a homeostase fornecida por astrócitos torna-se afetado, em relação a captação de glutamato normal, metabolismo energético, troca de moléculas ativas e antioxidante atividade¹³.

Reativados astrócitos proliferam em torno do tecido de infarto enquanto leucócitos migram para o lesado área¹⁴. Hamartomas proliferação pode ser medida usando marcadores como antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), Ki67 e bromodeoxyuridine (BrdU)¹⁵. Esta resposta proliferativa é gerada de forma dependente do tempo e ajuda a formar a cicatriz glial, uma matriz de astrócitos reativos irreversivelmente ao longo do parênquima do local danificado após uma lesão de⁹. Uma das funções iniciais desta cicatriz é limitar o extravasamento de células imunes dessa área. No entanto, estudos têm mostrado que a cicatriz se torna um impedimento físico para axônios estender, como eles liberam moléculas inibindo o crescimento axonal e criar uma barreira física, impedindo que os axônios estendendo-se ao redor da área lesada¹⁶. No entanto, há evidências científicas mostrando que após uma lesão na medula espinhal, impedir completamente a formação de cicatriz glial pode prejudicar a regeneração de axônios¹⁷. Assim, o contexto no qual é medida a resposta hamartomas específica, deve ser considerado em cima do quadro da lesão estudada.

A metodologia apresentada pode ser aplicada para estudar a função individualizada de astrócitos após privação de glicose oxigênio e ele pode ser modificado dependendo as perguntas que o investigador quer responder. Por exemplo, além da alteração morfológica e os marcadores expressados em momentos diferentes do OGH, os sobrenadantes de astrócitos expostos a OGH podem ser mais analisados para identificar fatores solúveis liberados por essas células, ou usado como uma mídia condicionada para avaliar sua efeito em outras células do cérebro. Esta abordagem permite estudos sobre reatividade astrocyte que poderia levar a elucidação dos fatores que governam e modulam sua resposta em um cenário acidente vascular cerebral isquêmico.

Protocol

pós-natal ratos (Sprague Dawley) 1-4 dias de idade são usados para isolar os córtices. O método de eutanásia é decapitação, conforme aprovado pelas diretrizes do NIH. 1. preparação de instrumentos e materiais para cirurgia instrumentos esterilize em autoclave (temperatura: 121 ° c, pressão: 15 libras por polegada quadrada, tempo: 30 minutos) usando uma caixa de aço ou uma mágica instantânea selagem bolsa de esterilização. Ver os materiais na Tabela de mater…

Representative Results

Uma das principais preocupações da cultura hamartomas primária é a presença de outras células, como neurônios, oligodendrócitos, micróglia e fibroblastos. Na Figura 1, células isoladas de córtices rato tinham alterações de mídia a cada 3 dias em foram ou não tratada ou tratada com adicionado LME para 1 h. 24 horas mais tarde, as células foram immunostained para GFAP e counterstained com DAPI. Células não tratadas mostraram uma média de 39% …

Discussion

Este protocolo descreve o isolamento de astrócitos de córtices de rato. Neste método, é fundamental para diminuir a contaminação com outros tipos celulares como fibroblasto, oligodendrócitos e micróglia. Para reduzir o número de micróglia, várias medidas podem ser tomadas: mudando a mídia, orbital tremendo e tratamentos químicos. Uma vez que a pureza da cultura é confirmada por imunofluorescência usando marcadores celulares seletivas ou para os contaminantes mais proeminentes de célula, experiências pode…

Materials

Instruments for Surgery – Step 1
Operating scissor 5.5”	Roboz Company	RS-6812	Tools used to decapitate the rats.
Curved forceps 7”	Roboz Company	RS-5271	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting scissors 4”	Roboz Company	RS-5882	Cuts both the skin and skull of the rat.
Micro-dissecting forceps 4” angled, fine sharp	Roboz Company	RS-5095	Holds the skin of the rat while the skull is removed.
Micro-dissecting forceps 4” slightly curved 0.8	Roboz Company	RS-5135	Tool used to separate cortices.
Micro-dissecting tweezers	Roboz Company	RS-4972	Peels brain meninges.
Dissection microscope	Olympus	SZX16	Important for removing the meninge from the cortices.
DMEM Preparation – step 2
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)	GibCo. Company	11995-065	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
Filter System 1L with 0.22um pore	Corning	431098
Astrocyte culture – step 3
Serological pipets 5mL	VWR	89130-896	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 10mL	VWR	89130-898	To pipette DMEM to containers with cells.
Serological pipets 25mL	VWR	89130-900	To pipette DMEM to containers with cells.
Centrifuge conical tube 15mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-200250
Safe-lock tube 1.5mL	Eppendorf	022363204
Barrier Tips 200 uL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201725
Barrier Tips 1 mL	Santa Cruz Biotechnology	sc-201727
Biohazard Orange Bag 14 x 19"	VWR	14220-048
60mm petri dishes	Falcon	351007
Sterile gauze pads	Honeywell Safety	89133-086
Stomacher 80 Biomaster	Sewar Lab System	030010019	Triturate the brain tissue.
Stomacher 80 Blender Sterile Bags	Sewar Lab System	BA6040	Sterile bag for the stomacher cell homogenizer.
Beaker 400mL	Pyrex	1000
Sterile cell dissociation sieve, mesh #60	Sigma-Aldrich Company	S1020	To obtain a uniform single cell suspension.
Sterile cell dissociation sieve, mesh #100	Sigma-Aldrich Company	S3895	To obtain a uniform single cell suspension.
Invert phase microscope	Nikon	Eclypse Ti-S	Verify cells for contamination or abnormal cell growth.
75cm2 sterile flasks	Falcon	353136
Multi-well plate	Falcon	353046
Micro cover glasses (coverslips), 18mm, round	VWR	48380-046
Bright-Line hemacytometer	Sigma-Aldrich Company	Z359629
Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
Ethyl alcohol	Sigma-Aldrich Company	E7023
L-leucine methyl ester hydrochloride 98% (LME)	Sigma-Aldrich Company	L1002	Promotes the elimination of microglia cells in the primary cortical astrocyte cultutre.
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C)	Sigma-Aldrich Company	C1768
Poly-D-Lysine Hydrobromide, mol wt 70,000-150,000	Sigma-Aldrich Company	P0899
Trypsin/EDTA	GibCo. Company	15400-054
Trypan Blue	Sigma-Aldrich Company	T8154
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Sterile Water	Sigma-Aldrich Company	W3500
OGD Medium Preparation – step 5
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Dulbecco’s modified Eagle’s medium-free glucose	Sigma-Aldrich Company	D5030	Supports the growth of cells.
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich Company	S7277	Supplement for the cell culture media.
Penicillin-Streptomycin	GibCo. Company	15140-148	Inhibits the growth of bacterias in the cell culture.
200mM  L-glutamine	GibCo. Company	25030-081	Amino acid that supplements the growth of cells.
Phospahet buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Filter System 50mL with 0.22um pore	Corning	430320
Centrifuge conical tube 50 mL	VWR	89039-658
Single Flow Meter	Billups-Rothenberg	SMF3001	Measure gas flow in oxygen purge.
Hypoxia Incubator Chamber	StemCell	27310	Generates a hypoxic environment for the cell culture.
Traceable Dissolved Oxygen Meter	VWR	21800-022
95% N2/ 5% CO2 Gas Mixture	Linde		Purges the environment of oxygen.
primary astrocyte immunofluorescence – step 6
Phosphate buffer saline (PBS) tablets	Calbiochem	524650
Formaline Solution Neutral Buffer 10%	Sigma-Aldrich	HT501128	Solution used to fix cells.
Methanol	Fisher	A4544	Solution used to fix cells.
Non-ionic surfactant (Triton X-100)	Sigma-Aldrich	T8787
Fetal bovine serum (FBS)	GibCo. Company	10437-010	Serum-supplement for the cell culture.
Anti-NeuN	Cell Signaling	24307	Detects mature neurons, serves to validate the astrocytic culture.
Anti-PCNA	Cell Signaling	2586	Detects proliferating cells.
Propidium Iodide (PI)	Sigma-Aldrich Company	P4170	Apoptosis staining.
Anti-Olig1	Abcam	AB68105	Detects mature oligodendrocytes.
Anti-Iba1+	Wako	016-20001	Detects microglial cells.
Anti-GFAP Conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich Company	C9205	Detects reactive astrocytes in the treated cells.
Alexa Fluor 488	Molecular Probe Life Technology	A1101	Anti-Mouse Secondary Antibody
Alexa Fluor 555	Molecular Probe Life Technology	A21428	Anti-Rabbit Secondary Antibody
4’,6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich Company	D9542	Nuclear staining
Confocal microscope	Olympus