Analyse des protéines Cap-liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques de l'oxygène
Summary
Here, we present human cell culture protocols to analyze translation initiation factors that bind the 5′ cap of mRNA during physiological oxygen conditions. This method utilizes an Agarose-linked m7GTP cap analog and is suitable to investigate cap-binding factors and their interacting partners.
Abstract
Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex is by far the most common pathway to initiate protein synthesis in eukaryotic cells, but stress-specific variations of this complex are now emerging. Purifying cap-binding proteins with an affinity resin composed of Agarose-linked m7GTP (a 5′ mRNA cap analog) is a useful tool to identify factors involved in the regulation of translation initiation. Hypoxia (low oxygen) is a cellular stress encountered during fetal development and tumor progression, and is highly dependent on translation regulation. Furthermore, it was recently reported that human adult organs have a lower oxygen content (physioxia 1-9% oxygen) that is closer to hypoxia than the ambient air where cells are routinely cultured. With the ongoing characterization of a hypoxic eIF4F complex (eIF4FH), there is increasing interest in understanding oxygen-dependent translation initiation through the 5′ mRNA cap. We have recently developed a human cell culture method to analyze cap-binding proteins that are regulated by oxygen availability. This protocol emphasizes that cell culture and lysis be performed in a hypoxia workstation to eliminate exposure to oxygen. Cells must be incubated for at least 24 hr for the liquid media to equilibrate with the atmosphere within the workstation. To avoid this limitation, pre-conditioned media (de-oxygenated) can be added to cells if shorter time points are required. Certain cap-binding proteins require interactions with a second base or can hydrolyze the m7GTP, therefore some cap interactors may be missed in the purification process. Agarose-linked to enzymatically resistant cap analogs may be substituted in this protocol. This method allows the user to identify novel oxygen-regulated translation factors involved in cap-dependent translation.
Introduction
Contrôle translationnelle émerge comme une étape tout aussi important de la régulation transcriptionnelle de l'expression génique, en particulier pendant les périodes de stress cellulaire 1. Un point central de contrôle de la traduction est à l'étape de limitation de vitesse d'initiation où les premières étapes de la synthèse des protéines impliquent la liaison de la facteur d'initiation eucaryote 4E (eIF4E) à la 7-méthylguanosine (m 7 GTP) coiffe 5 'des ARNm 2 . eIF4E fait partie d'un complexe trimère nommé eIF4F qui comprend eIF4A, un ARN hélicase et eIF4G, une protéine d'échafaudage nécessaire pour le recrutement d'autres facteurs de traduction et les 40S ribosome 3. Dans des conditions physiologiques normales, la grande majorité des ARNm sont traduits par un mécanisme de cap-dépendante, mais sous des périodes de stress cellulaire environ 10% des ARNm humains contiennent 5 'UTR qui pourraient permettre la traduction cap-indépendante intiation 1,4. Traduction de Cap-dépendante a été synonyme historiquementous avec eIF4F, cependant, des variations spécifiques au stress de eIF4F sont devenus un sujet tendance 5-8.
Diverses contraintes cellulaires provoquent l'activité eIF4E à être réprimée par la cible mammalienne de la rapamycine complexe 1 (mTORC1). Cette kinase devient douteux sous contrainte, ce qui se traduit par l'augmentation de l'activité de l'un de ses objectifs, la protéine 4E-liaison (4E-BP). Non-phosphorylée 4E-BP se lie à eIF4E et bloque sa capacité à interagir avec eIF4G provoquant la répression de la traduction cap-dépendante 9,10. Fait intéressant, un homologue de eIF4E nommé eIF4E2 (ou 4EHP) a une affinité beaucoup plus faible pour les 4E-BP 11, peut – être ce qui lui permet d'échapper au stress médiée par la répression. En effet, tout d' abord caractérisé comme répresseur de la traduction en raison de son manque d'interaction avec eIF4G 12, eIF4E2 initie la traduction de centaines d'ARNm qui contiennent des éléments de réponse à l'hypoxie d'ARN dans les 3 'UTR lors d'un stress hypoxique 6,13. Cette i d'activations obtenus par des interactions avec eIF4G3, l' ARN de liaison aux protéines motif 4 et le facteur inductible par l'hypoxie (HIF) , 2α pour constituer un complexe eIF4F hypoxique ou eIF4F H 6,13. En tant que répresseur dans des conditions normales, eIF4E2 se lie avec GIGYF2 et 14 ZNF598. Ces complexes ont été, en partie, identifiés par m 7 résines GTP d'affinité Agarose liés. Cette méthode classique 15 est standard dans le domaine de la traduction et les dosages meilleur et le plus couramment utilisé la technique pour isoler les complexes de plafonnement contraignant pull down et in vitro de liaison 16-19. Comme le mécanisme de traduction cap-dépendante est en train de devenir flexible et adaptable avec des parties inter-changer 6-8,13, cette méthode est un outil puissant pour identifier rapidement de nouvelles protéines cap de liaison impliqués dans la réponse au stress. Par ailleurs, les variations de eIF4F pourraient avoir de vastes répercussions que plusieurs systèmes modèles eucaryotes semblent utiliser un homologue eIF4E2 pour les réponses de stress tellescomme A. thaliana 20, S. pombe 21, D. melanogaster 22, et C. elegans 23.
Les preuves suggèrent que les variations de eIF4F peuvent ne pas être strictement limitées aux conditions de stress, mais être impliqués dans la physiologie normale 24. L'apport d'oxygène aux tissus (au niveau des extrémités des capillaires) ou dans les tissus (mesurée par microélectrodes) varie de 2 à 6% dans le cerveau 25, 3-12% dans les poumons 26, 3,5-6% dans l'intestin 27, 4% le foie 28, 7-12% dans le rein 29, 4% dans le muscle 30, et 6-7% dans la moelle osseuse 31. Les cellules et les mitochondries contiennent moins de 1,3% d' oxygène 32. Ces valeurs sont beaucoup plus proches de l'hypoxie que l'air ambiant où les cellules sont cultivées en routine. Cela donne à penser que ce qui était auparavant considéré comme des processus cellulaires spécifiques à l'hypoxie peuvent être pertinents dans un contexte physiologique. Il est intéressant de eIF4F et eIF4F H </sup> participer activement à l'initiation de la traduction des piscines ou des classes d'ARNm distincts dans plusieurs lignées cellulaires humaines différentes exposées à l' oxygène physiologique ou "physioxia" 24. Le manque d' oxygène entraîne également le développement du fœtus 33 et les cellules ont généralement des taux plus élevés de prolifération, plus la durée de vie, moins de dommages de l' ADN et moins les réactions de stress général dans physioxia 34. Par conséquent, eIF4F H est probablement un facteur clé dans l'expression de certains gènes dans des conditions physiologiques.
Ici, nous fournissons un protocole aux cellules de culture dans des conditions d'oxygène physiologiques fixes ou dans une gamme fluctuant dynamique qui est probablement plus représentatif de microenvironnements tissulaires. Un avantage de cette méthode est que les cellules sont lysées à l'intérieur du poste de travail de l'hypoxie. Il est pas souvent clairement comment la transition de la culture de cellules hypoxiques à la lyse cellulaire est effectuée dans d'autres protocoles. Les cellules sont souvent d'abord retirés d'un petit incubateur d'hypoxie êtreavant la lyse, mais cette exposition à l' oxygène pourrait affecter les voies biochimiques comme la réponse cellulaire à l' oxygène est rapide (une ou deux minutes) 35. Certaines protéines cap de liaison exigent des interactions avec une seconde base ou peuvent hydrolyser le m 7 GTP, donc certains interacteurs cap peuvent manquer dans le processus de purification. Agarose liée aux analogues de cap enzymatiquement résistant peut être substitué dans ce protocole. Exploration de l'activité et la composition des eIF4F H et d' autres variations de eIF4F par la méthode décrite ici va faire la lumière sur les gènes machineries d'expression complexes que les cellules utilisent dans des conditions physiologiques ou des réactions de stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'analyse des protéines cap de liaison dans les cellules humaines exposées à des conditions physiologiques d'oxygène peut permettre l'identification de nouveaux facteurs initiation de la traduction de l'oxygène réglementé. L'affinité de ces facteurs pour le coiffe 5 'd'ARNm ou d' autres protéines cap-associé peut être mesurée par la force de leur association à m 7 GTP lié perles Agarose. Une limitation de cette technique est qu'elle mesure le potentiel de la c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada and the Ontario Ministry of Research and Innovation.
Materials
| γ-aminophenyl-m7GTP agarose C10-linked beads | Jena Bioscience | AC-1555 | Agarose-linked m7GTP |
| 100 mm culture dish | Corning | 877222 | 10-cm culture dish |
| 150 mm culture dish | Thermofisher | 130183 | 15-cm culture dish |
| AEBSF Hydrochloride | ACROS Organics | A0356829 | AEBSF |
| Agarose Beads | Jena Bioscience | AC-0015 | Agarose bead control |
| Bromophenol Blue | Fisher | BP112-25 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | FroggaBio | 1210-00S | Used to centrifuge small volumes |
| 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher | 1495970C | Used in culturing primary cells |
| Defined trypsin inhibitor | Fisher | R007100 | DTI |
| Dithiothreital | Fisher | BP172-25 | DTT |
| Epithelial cell medium (complete kit) | ScienCell | 4101 | Includes serum and growth factor supplements) |
| Glycerol | Fisher | BP229-1 | Component of SDS-PAGE loading buffer |
| 100 mM Guanosine 5'-triphosphate, 1 mL | Jena Bioscience | 272076-0251M | GTP |
| HCT116 colorectal carcinoma | ATCC | CCL-247 | Human cancer cell line |
| Human renal proximal tubular epithelial cells | ATCC | PCS-400-010 | HRPTEC |
| Hyclone DMEM/High Glucose | GE Life Sciences | SH30022.01 | Standard media for human cell culture |
| Hyclone Penicillin-Streptomycin solution | GE Life Sciences | SV30010 | Antibiotic component of DMEM |
| H35 HypOxystation | Hypoxygen | N/A | Hypoxia workstation |
| Igepal CA-630 | MP Biomedicals | 2198596 | Detergent component of lysis buffer |
| Monopotassium phosphate | Fisher | P288-500 | KH2PO4 |
| Potassium chloride | Fisher | P217-500 | KCl |
| Magnesium chloride | Fisher | M33-500 | MgCl2 |
| Sodium chloride | Fisher | BP358-10 | NaCl |
| Sodium fluoride | Fisher | 5299-100 | NaF (phosphatase inhibitor component of lysis buffer) |
| Disodium phosphate | Fisher | 5369-500 | Na2HPO4 |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | FBS |
| Protease Inhibitor Cocktail (100 x) | Cell Signalling | 58715 | Component of lysis buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 | SDS |
| Sodium Orthovanadate | Sigma | 56508 | Na3VO4 |
| Tris Base | Fisher | BP152-5 | Component of buffers |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 2500-067 | Trypsin used to detach adherent cells |
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