من النوع البري منع PCR جنبا إلى جنب مع التسلسل المباشر كوسيلة الحساسة بشدة للكشف عن التردد المنخفض الجسدية الطفرات
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
كشف دقيق وتحديد الطفرات التردد المنخفض يمكن أن يكون مشكلة عند تقييم مرض المتبقية بعد العلاج، والكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج، أو عند المرضى الذين لديهم عدد قليل من تعميم الخلايا السرطانية. النوع البري منع PCR تليها تحليل التسلسل يوفر حساسية عالية، والمرونة، والبساطة كمنهجية للكشف عن هذه الطفرات التردد المنخفض. بإضافة مصممة خصيصا مقفل الحمض النووي النوكليوتيد لفحص تسلسل PCR أساس تقليدي جديد أو سابقا المعمول بها، الحساسيات ما يقرب من 1 أليل متحولة في خلفية من 1000 الأليلات WT يمكن أن يتحقق (1: 1000). التحف التسلسل المرتبطة بالأحداث نزع الأمين توجد عادة في الفورمالين الثابتة البارافين جزءا لا يتجزأ من الأنسجة يمكن معالجتها جزئيا عن طريق استخدام glycosylase DNA اليوراسيل خلال خطوات استخراج. بروتوكول الأمثل هنا هو محدد للكشف عن MYD88 الطفرة، ولكن يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتصميم أيWTB-PCR الفحص. مزايا الفحص WTB-PCR على فحوصات أخرى تستخدم عادة للكشف عن الطفرات ذات التردد المنخفض بما فيها أليل محددة PCR في الوقت الحقيقي والكمي PCR تشمل الحوادث أقل من ايجابيات كاذبة، وزيادة المرونة وسهولة التنفيذ، والقدرة على كشف كل معروف والطفرات غير معروفة.
Introduction
وكان سانجر تسلسل تقليديا معيار الذهب في اختبار لكل من الطفرات الجسدية المعروفة وغير المعروفة. واحد من أوجه القصور في سانجر التسلسل هو الحد الأقصى لها من الكشف (~ 10-20٪ أليل متحولة في خلفية WT) 1. هذا المستوى من الحساسية غير مناسب للكشف عن الطفرات الجسدية المستوى المنخفض التي قد تكون موجودة في عينات من أنسجة ما قبل سرطان أو المرضى الذين يعانون من بعض تعميم الخلايا السرطانية، أو عندما نخاع العظم (BM) غير متجانس. وهذا أيضا يجعل تقييم المرض المتبقية بعد العلاج أو الكشف عن الطفرات المقاومة الناشئة خلال فترة العلاج الصعبة التي التسلسل التقليدي وحده 2. من خلال استبدال PCR التقليدية مع الحمض النووي مقفل (LNA) بوساطة من النوع البري منع PCR (WTB-PCR) في سانجر تسلسل والحساسيات تصل إلى 0.1٪ أليل متحولة في خلفية WT يمكن أن يتحقق 2 و 3 و 4. فيWTB-PCR، ويتحقق إثراء لالأليلات متحولة عن طريق إضافة قصيرة (~ 10-14 NT) منع (LNA) النوكليوتيد التي ترتبط بشكل تفضيلي WT DNA وبالتالي منع التضخيم من WT DNA. والتخصيب المنتج WTB-PCR متحولة يمكن بعد ذلك التسلسل. من خلال منع WT DNA بدلا من اختيار للطفرات محددة WTB-PCR يسمح لتخصيب كل من الطفرات المعروفة وغير المعروفة الموجودة في أجزاء الخلية دقيقة.
وتستخدم أساليب متعددة في الوقت الحالي للكشف عن الطفرات في خلايا صغيرة كسور. وهذا يشمل PCR، التضخيم الحرارية نظام أليل محددة طفرة (ARMS)، تغيير طبيعة عالية الأداء اللوني السائل (DHPLC)، والخرز، والمستحلبات، والتضخيم، والمغناطيسية (مبتهجا)، الكهربائية الإفراج الناجم عن الميدان والقياس (EFIRM)، وارتفاع القرار نقطة انصهار وغيرها. ومع ذلك، فإن معظم هذه الأساليب تقتصر كل ايجابيات كاذبة والقدرة على كشف فقط طفرة واحدة التي تم تصميمها الفحص لمدة 4 </سوب>. WTB-PCR، ومع ذلك، تسمح للمستخدم تصور آثار التسلسل الذي يمكن من اكتشاف أنواع الطفرات متعددة ويمكن أن تساعد في استبعاد ايجابيات كاذبة بسبب القطع الأثرية أو الأحداث نزع الأمين. الجيل التالي من التسلسل (خ ع) قد تقدم بديلا مناسبا لالتسلسل التقليدي، ومع ذلك، أكبر بكثير التكاليف والتعقيد وقتا أطول فحص تجعلها خيارا غير ضروري بالنسبة لكثير من أنواع المرض مع بعض الواسمات الجزيئية متميزة أو لرصد المرضى على العلاج لالناشئة الطفرات المقاومة. وعلاوة على ذلك، فإن معدلات إيجابية كاذبة عالية عندما يكتشف المتغيرات مع الترددات أليل متحولة أقل من 5٪، يمكن أن تشكل مشكلة بالنسبة NGS القائم على amplicon 5، 6.
نحن هنا لشرح الزيادة في الحساسية WTB-PCR الذي تحقق في الكشف عن الطفرات في التمايز النخاعي عامل 88 الجين كما وصفها البيطار وآخرون. 3 MYD88 mutatioنانوثانية هي العوامل التشخيصية والنذير مهمة في مرض فالدنشتروم (WM)، الغلوبولين المناعي وحيدة النسيلة اعتلال غامائي من أهمية مجهولة (الغلوبولين المناعي-MGUS)، الطحال الغدد الليمفاوية منطقة هامشية (SMZL)، ومنتشر كبير سرطان الغدد الليمفاوية B-الخلية (DLBCL). تم العثور على الطفرات MYD88 تقريبا في جميع حالات WM، وحوالي 50٪ من المرضى الذين يعانون المناعي M (الغلوبولين المناعي) -secreting MGUS. متضارب، تم العثور على الطفرات MYD88 في المائة فقط 0-6 المرضى الذين يعانون من SMZL وغائبة في المايلوما المتعددة 7 و 8. بسبب تداخل المورفولوجية، immunophenotypic، خلوي، والخصائص السريرية بين WM وSMZL أو المايلوما الغلوبولين المناعي-متعددة يمكن في كثير من الأحيان إلى تعقيد تشخيصات تفريقية، وجود طفرة MYD88 قد يكون بمثابة عامل تحديد المفيد 9. كما تم المرتبطة الطفرات MYD88 مع عبئا أكبر المرض في المرضى الذين يعانون من DLBCL وضعف البقاء على قيد الحياة بعد العلاج 7، </سوب> 10. بالإضافة إلى ذلك، لأن الطفرات MYD88 هي أكثر كثيرا ما وجدت في مثل B-الخلية (ABC) DLBCL تفعيلها من مركز جرثومي B-الخلية مثل (GCB) DLBCL أو الأساسي سرطان الغدد الليمفاوية المنصفية B-الخلية (PMBL)، MYD88 وضع طفرة قد تكون بمثابة علامة بديلة لنوع فرعي ABC 11 و 12.
بروتوكول مفصل المقدمة هنا بمثابة القالب الذي يمكن تطويرها فحوصات جديدة أو معظم فحوصات تسلسل القائمة يمكن أن تتكيف بسهولة مع الكشف بدقة الطفرات التردد المنخفض في مختلف أنواع العينة. ويمكن أيضا أن النهج أن تستخدم لرصد واكتشاف الطفرات المقاومة التي قد تتطور في أورام أو حتى البكتيريا التي قد تتطور بينما يعالج المرضى مع العلاج الموجه أو المضادات الحيوية. وعلاوة على ذلك، فإنه يتناول وسائل الانتصاف العديد من القضايا المرتبطة بتخصيب طفرة، ولا سيما في الأنسجة الثابتة الفورمالين جزءا لا يتجزأ من البارافين (FFPE).
Protocol
Representative Results
Discussion
فحص WTB-PCR الموصوفة هنا يستخدم مجموعة عامة من الاشعال مع جزئية منع يهدف إلى منع التضخيم من WT DNA خلال تمديد (الشكل 1). ثم التسلسل المنتج WTB-PCR لتحليل طفرية. فائدة WTB-PCR / سانجر تكمن في بساطته، ذات حساسية عالية، والإنتاجية العالية. باستخدام الإرشادات الموضحة هنا، فإن ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström’s macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
