Дикого типа Блокирование ПЦР в сочетании с прямым секвенированием как высоко чувствительный метод обнаружения низкочастотных соматические мутации
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
Точное обнаружение и идентификация мутаций низких частот может быть проблематичным при оценке остаточной болезни после терапии, скрининг для новых мутаций устойчивости во время терапии, или когда пациенты имеют несколько циркулирующих опухолевых клеток. Дикого типа блокирования ПЦР с последующим анализом секвенирования обеспечивает высокую чувствительность, гибкость и простоту в качестве методики для обнаружения этих низкочастотных мутаций. При добавлении специально созданных заперт олигонуклеотид нуклеиновой кислоты к новому или ранее установленные обычному анализу секвенирования на основе ПЦРА, чувствительность приблизительно 1 мутантной аллели в фоне 1000 WT аллелей может быть достигнута (1: 1000). Секвенирование артефакты, связанные с дезаминирования событий обычно находятся в фиксированных формалином парафином тканей могут быть частично устранены за счет использования урацила ДНК-гликозилазы во время стадии экстракции. Оптимизированный протокол здесь специфичен для обнаружения мутации MyD88, но может служить в качестве шаблона для разработки любогоWTB-ПЦР-анализ. Преимущества анализа WTB-PCR по сравнению с другими, обычно используемыми анализами для обнаружения низких мутаций частот, включая аллели специфического ПЦР в реальное время количественный ПЦР включают в себя меньшее количестве вхождений ложных срабатываний, большую гибкость и простоту реализации, а также способность обнаруживать как известные и неизвестные мутации.
Introduction
Sanger секвенирования традиционно является золотым стандартом тестирования как известных, так и неизвестных соматических мутаций. Одним из ограничений Sanger секвенирования является его пределом обнаружения (~ 10 – 20% мутантная аллель в фоне WT) 1. Этот уровень чувствительности не подходит для выявления соматических мутаций низкого уровня, которые могут присутствовать в образцах из тканей предраковых или пациентов с небольшим количеством циркулирующих опухолевых клеток, или, когда костный мозг (ВМ) является неоднородным. Это также делает оценки остаточной болезни после терапии или обнаружение новых мутаций устойчивости во время терапии затруднена только 2 обычной последовательностью. Путем замены обычной ПЦР с запертой нуклеиновой кислоты (LNA) -опосредованной дикого типа блокирующий ПЦР (WTB-ПЦР) в Sanger секвенирования, чувствительность до 0,1% мутантного аллеля в фоне WT может быть достигнуто 2, 3, 4. ВWTB-ПЦР, обогащение мутантных аллелей достигается с помощью добавления короткого (~ 10 – 14 NT) блокирующего (МШУ) олигонуклеотид, который связывается преимущественно с БТ ДНК, тем самым предотвращая амплификации ДНК WT. Мутант, обогащенный продукт WTB-ПЦР может быть затем секвенировали. Блокируя WT ДНК, а не для выбора специфических мутаций WTB-ПЦР позволяет для обогащения известных и неизвестных мутаций, присутствующих в мельчайших фракциях клеток.
Различные методы в настоящее время используются для обнаружения мутаций в клетках небольших фракций. Это включает в себя аллель-специфической ПЦР-амплификации рефрактерной системы мутации (ARMS), денатурирующих высокоэффективной жидкостной хроматографии (DHPLC), шариков, эмульсий, усиления и магнетизмом (сияя), выпуск электрического поля индуцированный и измерения (EFIRM), высокое разрешение температура плавления и другие. Тем не менее, большинство из этих методов ограничены ложноположительных и способность обнаруживать только одну мутацию , что анализ был разработан для 4 </SUP>. WTB-PCR, однако, позволяет пользователю визуализировать секвенирование следов, позволяет обнаружение нескольких типов мутаций и может помочь в управлении ложных срабатываний из-за артефакты или дезаминирование событий. Секвенирование следующего поколения (NGS) может предложить подходящую альтернативу традиционным секвенирования, однако, значительно большие затраты, сложность и более длительное время для анализа делают его ненужную вариант для многих типов заболеваний с небольшим количеством различных молекулярными маркерами или для мониторинга пациентов на терапии для новых мутации устойчивости. Кроме того, высокие ложные срабатывания при обнаружении варианты с мутантными аллелями частотами менее 5% может вызвать проблемы для ампликона на основе NGS 5, 6.
Здесь показано увеличение чувствительности достигается за счет WTB-ПЦР в скрининга мутаций в миелоидной дифференцировки фактор 88 гена , как описано Albitar и соавт. 3 MyD88 mutatioнс являются важными диагностическими и прогностическими факторами в макроглобулинемии Вальденстремы (WM), IgM моноклональной гаммапатии неизвестного значение (IgM-MGUS), селезеночная лимфомы маргинальной зоны (SMZL) и диффузный крупноклеточные В-клеточная лимфому (ДВККЛО). MyD88 мутации встречаются практически во всех случаях WM и приблизительно 50% пациентов с иммуноглобулином М (IgM) -secreting MGUS. И наоборот, MyD88 мутации встречаются только в 0-6% пациентов с SMZL и отсутствуют в множественной миеломой 7, 8. Из – за перекрывающие морфологические, иммунофенотипический, цитогенетические и клинические характеристики между WM и SMZL или IgM-множественной миеломой часто может осложнить дифференциальные диагнозы, наличие мутации MyD88 может служить полезным идентифицирующим фактором 9. MyD88 мутация также была связана с большим бременем болезни у пациентов с ДВККЛОМ и плохой общей выживаемостью после лечения 7, </SUP> 10. Кроме того, поскольку MyD88 мутация чаще обнаруживается в активированных В-клетках, как (ABC) ДВККЛО чем зародышевый центр В-клеточный тип (БКИ) ДККВЛ или первичную лимфому медиастинальных В-клетки (ПМБЛ), статус мутации MyD88 могут служить суррогатный маркер для подтипа ABC 11, 12.
Подробный протокол, представленный здесь служит в качестве матрицы, с которой новые анализы могут быть разработаны или большинство существующего секвенирования анализов могут быть легко адаптированы для точного обнаружения низкочастотных мутаций в разных типах образцов. Подход также может быть использован для контроля и обнаружения устойчивых мутаций, которые могут возникнуть в опухолях или даже бактерий, которые могут возникнуть в то время как пациенты проходят лечение с целевой терапией или антибиотиками. Кроме того, в нем рассматривается и средства правовой защиты, многие из проблем, связанных с обогащением мутаций, особенно в формалине фиксированного парафина (FFPE) ткани.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ WTB-ПЦР , описанный здесь используется общий набор праймеров с блокирующим олигонуклеотидом , предназначенным для блокирования амплификации ДНК WT при растяжении (рисунок 1). Продукт WTB-ПЦР секвенировали для мутационного анализа. Полезность WTB-PCR / Sanger заключается в его про?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström’s macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
