Villtype Blokkering PCR Kombinert med direkte sekvensering som en svært følsom metode for påvisning av lavfrekvent somatiske mutasjoner

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

Presis deteksjon og identifikasjon av lavfrekvens-mutasjoner kan være problematisk ved vurdering av restsykdom etter behandling, screening for vekst resistensmutasjonene under behandling, eller når pasientene har noen sirkulerende tumorceller. Vill-type blokkerende PCR etterfulgt av sekvensanalyse gir høy følsomhet, fleksibilitet og enkelhet som en metode for å påvise disse lavfrekvente mutasjoner. Ved å legge til en spesialdesignet låst nukleinsyre oligonukleotid til en ny eller tidligere etablert konvensjonell PCR-sekvenseringsanalyse, kan følsomheten til omtrent 1 mutant allel i en bakgrunn av 1000 WT alleler bli oppnådd (1: 1000). Sekvenserings gjenstander forbundet med deaminering hendelser som vanligvis finnes i formalinfikserte paraffininnstøpte vev kan delvis avhjelpes ved bruk av uracil-DNA glycosylase under ekstraksjonstrinnene. Den optimaliserte protokollen her er spesifikk for påvisning av MyD88 mutasjon, men kan tjene som en mal for å konstruere et hvilket som helstWTB-PCR-analyse. Fordeler med den WTB-PCR-analyse i forhold til andre vanlig anvendte analyser for påvisning av lavfrekvens-mutasjoner, inkludert allele spesifikk PCR og real-time kvantitativ PCR omfatter færre tilfeller av falske positiver, større fleksibilitet og enkel implementering, og evnen til å detektere både kjente og ukjente mutasjoner.

Introduction

Sanger-sekvensering har tradisjonelt vært gullstandarden i testing for både kjente og ukjente somatiske mutasjoner. En av begrensningene ved Sanger-sekvensering er deteksjonsgrensen (~ 10 – 20% mutant allel i en bakgrunn av WT) ^1. Dette nivået av følsomhet er upassende for å detektere lavt nivå somatiske mutasjoner som kan være tilstede i prøver fra pre-maligne vev eller pasienter med noen sirkulerende tumorceller, eller når benmarg (BM) er usammenhengende. Dette gjør også vurdere restsykdom etter terapi eller detektering av vekst resistens mutasjoner i løpet av behandlingen vanskelig ved konvensjonelle sekvensering alene ^2. Ved å erstatte konvensjonelle PCR med låst nukleinsyre (LNA) -mediert villtype-blokkerende PCR (WTB-PCR) i Sanger-sekvensering, følsomheter på opp til 0,1% mutant allel i en bakgrunn av WT kan oppnås ^{2, 3, 4.} IWTB-PCR, er berikelse for mutante alleler oppnås via tilsetning av et kort (~ 10 – 14 NT) blokkering (LNA) oligonukleotid som bindes fortrinnsvis til WT-DNA for derved å forhindre forsterkning av WT-DNA. Den mutante anrikede WTB-PCR-produktet kan deretter bli sekvensert. Ved å blokkere WT-DNA i stedet for å selektere for spesifikke mutasjoner WTB-PCR tillater anrikning av både kjente og ukjente mutasjoner er tilstede i små cellefraksjoner.

Flere fremgangsmåter er for tiden benyttes for å påvise mutasjoner i små celler fraksjoner. Dette omfatter allel-spesifikk PCR-amplifikasjon-ildfast mutasjon system (ARMS), denaturerende væskekromatografi med høy ytelse (DHPLC), perler, emulsjoner, forsterkning, og Magnetics (strålte), elektrisk felt-indusert frigjøring og måling (EFIRM), høyoppløsnings smeltepunkt og andre. Imidlertid er de fleste av disse fremgangsmåter begrenset av falsk-positive og evnen til bare å påvise en mutasjon som analysen ble konstruert for ^fire </sup>. WTB-PCR, men tillater brukeren å visualisere sekvense spor som muliggjør påvisning av flere mutasjonstyper og kan hjelpe til med å utelukke falske positive på grunn av gjenstander eller deaminering hendelser. Neste generasjon sekvensering (NGS) kan tilby et egnet alternativ til konvensjonell sekvensering, er imidlertid betydelig større kostnader, kompleksitet og lengre analysetiden gjør det unødvendig alternativ for mange sykdomstyper med noen distinkte molekylære markører eller for å overvåke pasienter under behandling for vekst resistensmutasjoner. Videre høye falske positive når påvisnings varianter med muterte allel frekvenser på mindre enn 5% kan utgjøre et problem for amplikonet NGS-baserte ^{5, 6.}

Her viser vi økningen i følsomhet oppnås ved WTB-PCR i screening for mutasjoner i den myeloide differensieringsfaktor 88-genet, som beskrevet ved Albitar et al. ³ MyD88 mutations er viktige diagnostiske og prognostiske faktorer i Waldenstrøms makroglobulinemi (WM), IgM monoklonal gammopati av ukjent betydning (IgM-MGUS), miltens marginalsone lymfom (SMZL), og diffus stor B-celle lymfom (DLBCL). MyD88 mutasjoner er funnet i nesten alle tilfeller av WM og ca 50% av pasientene med immunglobulin M (IgM) -secreting MGUS. I kontrast til dette, er MyD88 mutasjoner funnet i bare 0-6% av pasientene med SMZL og er fraværende i multippel myelom ^{7, 8.} Fordi overlappende morfologiske, immunophenotypic, cytogenetisk, og kliniske karakteristika mellom WM og SMZL eller IgM-multippelt myelom kan ofte komplisere differensialdiagnoser, kan tilstedeværelsen av en mutasjon MyD88 tjene som en nyttig å identifisere faktor ^9. MyD88 mutasjoner har også vært forbundet med større sykdomsbyrde hos pasienter med DLBCL og dårlig total overlevelse etter behandlingen ^7, </sup> ^10. I tillegg, fordi MyD88 mutasjoner er mer hyppig finnes i aktiverte B-celle-lignende (ABC) DLBCL enn germinalsenter B-celle-lignende (GCB) DLBCL eller primær mediastinalt B-celle lymfom (PMBL), kan MyD88 mutasjons status tjene som en surrogatmarkør for ABC-subtype ^{11, 12.}

Den detaljerte protokoll som fremlegges her tjener som en mal som nye analyser kan utvikles eller de fleste eksisterende sekvenseringsanalyser kan enkelt tilpasses for nøyaktig bestemmelse av lavfrekvens-mutasjoner i forskjellige prøvetyper. Tilnærmingen kan også brukes for å overvåke og detektere motstandsdyktig mutasjoner som kan utvikle seg i tumorer eller bakterier som kan utvikle seg, mens pasienter som behandles med målrettet terapi eller antibiotika. Videre omhandler det og remedier mange av problemene forbundet med mutasjon berikelse, spesielt i formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) vev.

Protocol

Etikk Uttalelse: All testing av humane prøver ble utført etter å skaffe Institutional Review Board (IRB) godkjennelse. 1. DNA-ekstraksjon fra FFPE Tissue, perifert blod, og benmargsaspirat For benmarg FFPE vevet med DNA FFPE ekstraksjonssett Begynn med FFPE vev fra ufargede bakker (5 – 10 seksjoner ved 5 – 10 um tykkelse). MERK: Hvis starten med vev spon, bruke 3 – 6 deler ved 5 – 10 um tykkelse og går videre til trinn 1.1.6. Plasser glir i en glide k…

Representative Results

Et begrepsmessig oversikt over WTB-PCR under utvidelsen er presentert i figur 1. Fordi et enkelt nukleotid mistilpasning i blokkerings-DNA hybrid sterkt reduserer dets smeltetemperatur (aT m = 20 – 30 ° C), forsterkning av WT allelet er sperret mens mutant templat-DNA er fri til å fullføre forlengelsen 17. På denne måte blir mutant-DNA amplifiseres eksponentielt, mens WT-DNA blir amplifisert lineært. <p class="jove_content" fo…

Discussion

WTB-PCR-assay som er beskrevet her anvender en generisk sett av primere med en blokkerende oligo utformet for å blokkere amplifikasjon av WT-DNA under forlengelse (figur 1). WTB-PCR-produktet blir deretter sekvensert for mutasjonsanalyse. Anvendeligheten av WTB-PCR / Sanger ligger i dens enkelhet, høy følsomhet og høy gjennomstrømming. Ved å bruke de retningslinjer som er beskrevet her, kan de fleste eksisterende Sanger-baserte analyser på enkel måte modifiseres ved tilsetning av et blokkerings …

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)	Roche	12032937001	With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1000 µl
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~1000 ml
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade