Sauvage Blocking PCR Combiné avec le séquençage direct comme méthode très sensible pour la détection de basse fréquence Somatic Mutations

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

la détection et l'identification précise des mutations à basse fréquence peut être problématique lors de l'évaluation de maladie résiduelle après le traitement, le dépistage des nouvelles mutations de résistance au cours du traitement, ou lorsque les patients ont peu de cellules tumorales circulantes. PCR blocage de type sauvage suivi par une analyse de séquençage offre une sensibilité élevée, la flexibilité et la simplicité comme une méthodologie permettant de détecter ces mutations à basse fréquence. En ajoutant un oligonucleotide conçu sur mesure d'acide nucléique verrouillé dans une nouvelle ou déjà établie essai de séquençage à base de PCR classique, des sensibilités de l'ordre de 1 allele mutant dans un fond de 1000 WT alleles peuvent être atteints (1: 1000). artefacts de séquençage associés à des événements de désamination généralement trouvés dans des tissus inclus dans la paraffine fixés au formol peut être remédié en partie par l'utilisation de l'uracile glycosylase d'ADN au cours des étapes d'extraction. Le protocole optimisé de détection est spécifique ici pour la mutation MyD88, mais peut servir de modèle pour concevoir toutedosage WTB-PCR. Avantages du test WTB-PCR sur les autres essais couramment utilisés pour la détection de mutations à basse fréquence incluant allèle spécifique PCR et PCR en temps réel quantitative comprennent moins les occurrences de faux positifs, une plus grande souplesse et la facilité de mise en œuvre, et la capacité de détecter à la fois connue et des mutations inconnues.

Introduction

Le séquençage Sanger a toujours été l'étalon-or dans les tests pour les mutations somatiques connues et inconnues. L' une des limitations de séquençage de Sanger est sa limite de détection (~ 10 – allèle mutant de 20% dans un fond de WT) ^1. Ce niveau de sensibilité est inapproprié pour la détection de mutations somatiques de bas niveau qui peuvent être présents dans des échantillons de tissus de patients prémalignes ou avec peu de cellules tumorales circulantes, ou lorsque la moelle osseuse (BM) est inégale. Cela rend également l' évaluation de la maladie résiduelle après le traitement ou la détection des mutations de résistance émergents au cours du traitement par séquençage conventionnel seul difficile ^2. En remplaçant la PCR classique avec un acide nucléique verrouillé (LNA) médiée par PCR de blocage de type sauvage (WTB-PCR) dans le séquençage de Sanger, les sensibilités allant jusqu'à 0,1% allèle mutant dans un fond de WT peuvent être obtenus ^{2, 3, 4.} DansWTB-PCR, l'enrichissement pour les alleles mutants est réalisée par l'addition d'un court (~ 10 – 14 NT) de blocage (LNA) oligonucléotide qui se lie préférentiellement à l'ADN WT empêchant ainsi l'amplification de l'ADN WT. Le mutant enrichi produit WTB-PCR peut être séquencée. En bloquant l'ADN WT plutôt que de sélectionner des mutations spécifiques WTB-PCR permet l'enrichissement des deux mutations connues et inconnues présentes dans les fractions cellulaires minute.

Plusieurs méthodes sont actuellement utilisées pour détecter des mutations dans les petites fractions de cellules. Ceci inclut le système de mutation allèle-spécifique PCR, réfractaire amplification (ARMS), la dénaturation Chromatographie en phase liquide à haute performance (DHPLC), des billes, des émulsions, l'amplification et le magnétisme (ensouplage), la libération du champ induit électrique et de mesure (EFIRM), haute résolution point de fusion et d'autres. Cependant, la plupart de ces méthodes sont limitées par des faux positifs et la capacité de détecter une seule mutation que le test a été conçu pour ⁴ </sup>. WTB-PCR, cependant, permet à l'utilisateur de visualiser les traces de séquençage qui permet la détection de plusieurs types de mutation et peuvent aider à écarter les faux positifs dus à des artefacts ou des événements de désamination. séquençage de nouvelle génération (NGS) peut offrir une alternative appropriée au séquençage classique, cependant, essentiellement des coûts plus élevés, la complexité et plus le temps d'essai rendent une option inutile pour de nombreux types de maladies avec quelques marqueurs moléculaires distincts ou pour le suivi des patients sous traitement pour les nouveaux mutations de résistance. De plus, les taux élevés de faux positifs lors de la détection des variants avec des fréquences d'allèle mutant de moins de 5% peuvent poser un problème pour NGS à base ^{amplicons-5, 6.}

Ici , nous démontrons l'augmentation de la sensibilité obtenue par WTB-PCR dans le dépistage des mutations dans le facteur de différenciation myéloïde 88 gène tel que décrit par Albitar et al. ³ MYD88 mutations sont importants facteurs diagnostiques et pronostiques dans la macroglobulinémie de Waldenström (WM), gammapathie monoclonal IgM de signification inconnue (IgM-MGUS), le lymphome splénique de la zone marginale (SMZL) et lymphome diffus à grandes cellules B (DLBCL). mutations MyD88 se trouvent dans presque tous les cas de WM et environ 50% des patients avec des immunoglobulines M (IgM) sécrétant GMSI. Par contraste, les mutations MyD88 se trouvent dans seulement 0-6% des patients atteints de SMZL et sont absents dans le myélome multiple ^{7, 8.} Parce morphologiques qui se chevauchent, immunophénotypique, cytogénétique, et les caractéristiques cliniques entre WM et SMZL ou multiple IgM de myélome peuvent souvent compliquer le diagnostic différentiel, la présence d'une mutation MyD88 peut servir de facteur d' identification utile ^9. Mutations MyD88 ont également été associés à une plus grande charge de morbidité chez les patients atteints DLBCL et une mauvaise survie globale après un traitement ^7, </sup> ^10. De plus, parce que les mutations MyD88 sont plus fréquemment trouvés dans activé cellules B comme (ABC) DLBCL que centre germinatif B-alvéolaire (GCB) DLBCL ou de lymphome à cellules B médiastinale primaire (PMBL), le statut de mutation MYD88 peut servir marqueur de substitution pour le sous – type ABC ^{11, 12.}

Le protocole détaillé fourni ici sert de modèle à partir duquel de nouveaux tests peuvent être mis au point ou la plupart des tests de séquençage existants peuvent être facilement adaptés pour détecter avec précision les mutations à basse fréquence dans différents types d'échantillons. L'approche peut également être utilisé pour la surveillance et la détection de mutations résistantes qui peuvent se développer dans les tumeurs ou même les bactéries qui peuvent se développer alors que les patients sont traités avec la thérapie ciblée ou des antibiotiques. En outre, il traite et des remèdes beaucoup des problèmes liés à l'enrichissement de mutation, en particulier dans les paraffine fixés au formol (FFPE) tissus.

Protocol

Déclaration éthique: Tous les tests des échantillons humains a été réalisée après obtention de l'approbation Institutional Review Board (IRB). 1. Extraction de l'ADN à partir de tissu FFPE, du sang périphérique et de moelle osseuse Aspirer Pour la moelle osseuse du tissu FFPE avec le kit d'extraction d'ADN FFPE Commencer avec le tissu FFPE de lames non colorées (5 – 10 parties à 5 – épaisseur de 10 um). REMARQUE: si début de copeaux d…

Representative Results

Une vue d' ensemble conceptuelle de WTB-PCR lors de l' extension est présentée sur la figure 1. Étant donné qu'un seul mésappariement de nucleotide dans l'hybride ADN-bloqueur diminue considérablement sa température de fusion (AT m = 20 – 30 ° C), l' amplification de l'allèle WT est bloqué tandis que l' ADN matrice mutant est libre de compléter l' extension 17. De cette manière, l'ADN muta…

Discussion

Le dosage WTB-PCR décrit ici utilise un ensemble générique d'amorces avec un oligo blocage conçu pour bloquer l' amplification de l' ADN WT pendant l' extension (Figure 1). Le produit WTB-PCR est ensuite séquencée pour l'analyse mutationnelle. L'utilité de WTB-PCR / Sanger réside dans sa simplicité, de haute sensibilité, et à haut débit. En utilisant les directives décrites ici, la plupart des tests basés sur Sanger existants peuvent être simplement modifiés par l…

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)	Roche	12032937001	With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1000 µl
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~1000 ml
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade