와일드 형은 PCR은 낮은 주파수 체세포 돌연변이의 검출을위한 고감도 방법으로 직접 시퀀싱과 결합 블로킹

Summary

Wild-type blocking PCR에 이어 직접 염기서열분석(direct sequencing)은 다양한 샘플 유형에서 저주파 체세포 돌연변이를 매우 민감하게 검출할 수 있는 방법을 제공합니다.

Abstract

정확한 탐지 및 저주파 돌연변이의 식별은 치료 중 내성 돌연변이 신흥 심사, 치료 후 잔여 질병을 평가할 때 문제가 될, 또는 수의 환자가 몇 순환 종양 세포가있을 때. 서열 분석 하였다 PCR 차단 야생형 이러한 저주파 변이를 검출하는 방법으로 고감도, 유연성 및 단순성을 제공한다. 신설하거나 이전에 종래의 PCR 계 서열 분석에 핵산 올리고 뉴클레오티드 로크 설계 정의를 첨가함으로써, 1000 WT 대립 유전자의 배경에서 약 1 돌연변이 대립 유전자의 민감도 (1,000 1)를 실현할 수있다. 탈 아미 노화 이벤트와 연관된 시퀀싱 아티팩트 일반적 부분적 추출 단계 동안 우라실 DNA 글리코의 사용에 의해 해결 될 수 포르말린 고정 파라핀 조직에서 발견. 최적화 된 프로토콜은 여기에서 MyD88 돌연변이를 검출하기위한 특정이지만, 어떤을 설계하는 템플릿 역할을 할 수 있습니다WTB-PCR 분석. PCR 및 실시간 정량 PCR 가양 적게 발생, 유연성 및 구현의 용이성을 포함 특정 대립 유전자를 포함하여 낮은 주파수 변이의 검출에 대한 기타 일반적으로 사용되는 분석을 통해 WTB-PCR 분석의 장점, 둘 다 알려진 감지 할 수있는 능력 알 수없는 돌연변이.

Introduction

생거 시퀀싱은 전통적으로 알려진 알 수없는 체세포 돌연변이 시험에서 황금 표준되었습니다. 생거 시퀀싱의 한계 중 하나는 검출 한계 인 (~ 10 - WT의 배경에 20 % 돌연변이 대립 유전자 ^1). 감도 수준은 몇 순환 종양 세포 또는 골수 (BM)이 고르지 때와 암성 조직 또는 환자 샘플에 존재할 수있는 낮은 수준의 체세포 돌연변이를 검출하기위한 부적절한. 이것은 또한 치료 후 잔여 질병을 평가 또는 혼자 ^두 기존의 염기 서열에 의해 어려운 치료 중에 새로운 저항 변이를 감지한다. 잠긴 핵산 (LNA)와 종래의 PCR 대체함으로써 생거 시퀀싱에 PCR (WTB-PCR)을 차단 야생형를 매개 성, WT의 배경 최대 0.1 % 돌연변이 대립 유전자의 감도는 ^{2, 3, 4를} 달성 할 수있다. 에서WT WT DNA의 DNA 증폭 방지하여 우선적으로 결합 - (NT 14 ~ 10) 차단 (LNA) 올리고 WTB-PCR은, 돌연변이 대립 유전자 농축 짧은의 첨가를 통해 달성된다. 돌연변이 풍부한 WTB-PCR 제품은 다음 순서가 될 수있다. WT ....

Protocol

윤리 성명서 : 인간의 모든 샘플 테스트는 임상 시험 심사위원회 (IRB)의 승인을 얻은 후 시행 하였다.

1. FFPE 조직에서 DNA 추출, 말초 혈액 및 골수 대기음

1. DNA FFPE 추출 키트 골수 FFPE 조직에 대한
   1. 흠 슬라이드에서 FFPE 조직으로 시작 (5-5에서 10 절 - 10 μm의 두께).
      참고 : 조직 부스러기 시작, 3 개를 사용하는 경우 - 5에서 6 섹션 - 10 μm의 두께와 1.1.6 단계로 건너 뜁니다.
   2. 슬라이드 바구니 슬라이드 놓고 네 세척 저장소 (크실렌 두 100 % 알코올 개의)을 준비한다. 각 바스켓 용액을 600 mL의 최소 부피를 추가한다.
   3. 제 트레이에 5 분 크실렌 세척을 수행하여 슬라이드 Deparaffinize. 추가로 5 분 동안 제 크실렌 세척 저장소에 슬라이드 이동.
   4. 탈 파라핀 한 후, 5 분 동안 100 % 알코올로 슬라이드를 세척한다. 두 번째로 슬라이드를 이동추가로 5 분 동안 세척 알코올 저장조.
   5. 슬라이드가 microcentrifuge 관에 면도날로 근근이 살아가고하기 전에 후드를 완전히 말리십시오.
      참고 : 종양 지역과 H & E 슬라이드가 표시....

Results

확장시 WTB-PCR의 개념적 개관도 1에 제시된다. 블로커-DNA 하이브리드의 단일 염기 미스 매치가 크게의 용융 온도 감소하므로 (ΔT의 _m = 20 - 30 °의 C)에서, WT 대립 유전자의 증폭을 돌연변이 주형 DNA는 확장자 ^(17)을 완료 할 수없는 상태에서 차단된다. WT 선형 DNA 증폭 동안 이러한 방식으로, 돌연변이 DNA를 기하 급수적으로 증폭된다.

WTB-PCR에 의해 달성 돌연변이 농축 시연은도 2에 제시된다. 와 돌연변이가없는 환자의 게놈 DNA를 테스트했다 재래식 WTB-PCR 후 WTB-PCR에 의해 달성 전형적인 농축 및 WT DNA에 잘못된 반응의 부족을 보여 염기 서열. WTB MMX-PCR에 사용 된 .......

Discussion

여기에 설명 된 WTB-PCR 분석은 신장 (도 1) 동안 WT에 DNA의 증폭을 차단하기위한 차단 올리고 프라이머와 일반 세트를 사용한다. WTB-PCR 생성물은 돌연변이 염기 서열을 분석한다. WTB-PCR / 생어의 유틸리티는 단순, 높은 감도 및 높은 처리량에있다. 여기에 설명 된 지침을 사용하여, 대부분의 기존 생어 기반 분석은 단순히 크게 감도를 증가시키기 차단 올리고 뉴클레오티드의 추가를 통해 수정 될 수 있습니다. 여기에 제시된 실시 예 분석에서 PCR 단일 차단 올리고 뉴클레오티드의 첨가는 WTB-PCR 분석 ^3> 0.5 %의 통상적 인 분석에 대한 WT의 배경에서 약 16 % 돌연변이 대립 유전자의 검출 한계를 증가. 효과는 임상 시험 ³ 본 위음성의 64 % 감소된다. 에서 MyD88 돌연변이의 존재를 확인하는 것은 중요한 진단 및 예후 IMPL있다ications; 거짓 전반적인 치료와 .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 또는 2 mL Safe-Lock 마이크로 원심분리기 튜브	Eppendorf	05-402-25
100% 알코올	VWR	89370-084	조직학 등급; 91.5% 에탄올, 5% 이소프로필 알코올, 4.5% 메틸 알코올
3730XL 시퀀서	ABI		또는 동급
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	마그네틱 비드 PCR 정제용
알루미늄 밀봉 포일	GeneMate	T-2451-1	PCR 및 냉장 보관용
BigDye Terminator v3.1 주기 염기서열분석 키트	Life Technologies	4337455	양방향 염기서열분석용. 5x Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 시리즈	Eppendorf		A-2-DWP 로터(PCR 플레이트용)
96웰 플레이트용 냉각판	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, 초순수
dNTP (100 mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 사이드 스커트 자석	Thermo Fisher Scientific	12027	PCR 정제에 사용됩니다.
에탄올 앱솔루트	Sigma	E7023	200 proof, 분자생물학
Exiqon 웹사이트 Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/µ L)	Roche	12032937001	With10x 집중 PCR 반응 버퍼, 20 mM MgCl2
Gel 전기영동 장치			2% 아가로스 젤
GeneRead DNA FFPE 추출 키트	Qiagen	180134	서열분석 아티팩트를 줄이는 데 필요한 우라실 DNA 글리코실라아제를 함유
Hi-Di 포름아미드	ABI	4311320	염기서열분석을 위해 사용됩니다.
LNA 올리고뉴클레오티드	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA 염기)
M13-F 염기서열분석 프라이머	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R 염기서열분석 프라이머	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (1.5/2 mL microcentrifuge tubes용)
NanoDrop 2000 분광광도계	Thermo Fisher Scientific
PCR 포워드 프라이머	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR 리버스 프라이머	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
피펫터			20, 200, 1,000 &마이크로; L
플레이트 격막, 96 웰	ABI	4315933
QIAamp DNA 미니 키트	Qiagen	51304	BM 흡인 및 말초 혈액용
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	염기서열 분석
슬라이드 바구니
아세트산 나트륨 (3 M, pH 5.2)	Sigma	S7899
멸균 여과 피펫 팁			20, 200, 1,000 &마이크로; L
써모믹서 C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
세척 reservoir			~ 1,000 mL
Xylene	VWR	89370-088	조직학 등급