חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

Summary

Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.

Abstract

גילוי וזיהוי מדויק של מוטציות בתדירות נמוכה יכול להיות בעייתי כאשר להערכת מחלת שיורי לאחר טיפול, בדיקות סקר לאיתור מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול, או כאשר יש מטופלים כמה תאים סרטניים במחזור. Wild-סוג חסימת PCR ואחריו לניתוח רצפי מציעה רגישות גבוהה, גמישות, ופשטות כמו מתודולוגיה לאיתור מוטציות בתדירות נמוכה אלה. על ידי הוספת מעוצבים בהתאמה אישית נעול oligonucleotide חומצות גרעין אל assay סידור חדש או בעבר הקים קונבנציונאלי המבוסס PCR, רגישויות של כ 1 אלל מוטנטי רקע של 1000 אללים WT יכולה להיות מושגת (1: 1000). חפצי רצף אירועים הקשורים דיאמינציה נפוצים ברקמות מוטבעות פרפין קבוע בפורמלין ניתן לתיקון חלקי על ידי שימוש glycosylase DNA אורציל במהלך שלבי חילוץ. הפרוטוקול המותאם כאן הוא ספציפי לזיהוי מוטצית MYD88, אך יכול לשמש כתבנית לעצב כלassay WTB-PCR. יתרונות של assay WTB-PCR מעל מבחני אחרים מנוצלים בדרך כלל לאיתור מוטציות בתדירות הנמוכה כולל אלל ספציפי PCR ו PCR כמוני בזמן האמת כוללים מופעים פחות של תוצאות חיוביות שגויות, גמישות רבה יותר וקלות ליישום, ואת היכולת לזהות הן ידוע ומוטציות ידועות.

Introduction

רצף סנגר באופן מסורתי את תקן הזהב בדיקות עבור שתי מוטציות סומטיות ידועים ובלתי ידועים. אחת המגבלות של רצף סנגר הוא הגבול של זיהוי שלה (~ 10 – אלל מוטנטי 20% בתוך רקע של WT) ^1. רמה זו של רגישות אינה מתאימה לזיהוי מוטציות סומטיות ברמה הנמוכה שעשויה להיות נוכח דגימות מרקמות ממאירות או בחולים עם כמה תאים סרטניים במחזור, או כאשר מח עצם (BM), הוא מעשה טלאים. זה גם עושה הערכת מחלה שיורית לאחר טיפול או לגילוי מוטציות עמידות המתעוררים במהלך הטיפול קשה על ידי רצף קונבנציונאלי בלבד ^2. על ידי החלפת PCR קונבנציונאלי עם חומצות גרעין נעול (LNA) בתיווך wild-type חסימת PCR (WTB-PCR) ב רצף סנגר, רגישויות של עד 0.1 אלל מוטנטי% בתוך הרקע של WT ניתן להשיג ^{2, 3, 4.} בשנתWTB-PCR, העשרה עבור אללים מוטנטים מושג באמצעות התוספת של קצר (~ 10 – 14 NT) חסימה (LNA) oligonucleotide שקושרה מעדיפים את WT DNA ובכך למנוע ההגברה של WT DNA. מוצר WTB-PCR מועשר המוטציה יכול להיות רצף אז. על ידי חסימת WT DNA ולא בחירת מוטציות ספציפיות WTB-PCR מאפשרת העשרה של שניהם מוטציות ידועות ובלתי ידועים הנוכחות שברי תא דקות.

שיטות מרובות כיום משמשות לזיהוי מוטציות שברי תאים קטנים. זה כולל מערכת מוטצית אלל ספציפי PCR, הגברה-עקשנית (נשק), denaturing כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים (DHPLC), חרוזים, תחליבים, הגברה, ומגנטיות (קורן), שחרור מושרה שדה חשמלי ומדידה (EFIRM), ברזולוציה גבוהה נקודה ואחרים היתוך. עם זאת, רוב השיטות אלה מוגבלים-תוצאות חיוביות שגויות ואת היכולת לזהות רק מוטציה אחת כי assay תוכנן עבור ⁴ </sup>. WTB-PCR, לעומת זאת, מאפשרת למשתמש לדמיין עקבות רצף המאפשרת זיהוי של סוגי מוטציה מרובים ויכולים לסייע פוסלים תוצאות חיוביות שגויות עקב ממצאים או אירועים דיאמינציה. סידור הדור הבא (NGS) עשוי להציע חלופה הולמת סידור קונבנציונלי, אולם, עלויות משמעותיות גדולות יותר, מורכבות, וזמן assay כבר לדקלם את זה אופציה מיותרת עבור סוגי מחלות רבים עם כמה סמנים מולקולריים ברורים או לניטור מטופלים בתרופה עבור מתעוררים מוטציות עמידות. יתר על כן, שיעורי חיובי כוזבים גבוהים כאשר הגירסות באיתור עם תדרי אלל מוטנטי של פחות מ 5% יכולות להוות בעיה עבור NGS מבוסס amplicon ^{5, 6.}

כאן אנו מדגימים את הגידול רגיש מושג על ידי WTB-PCR הקרנה עבור מוטציות בגן 88 גורם בידול מיאלואידית כפי שתואר על ידי Albitar ואח. ³ MYD88 mutatioNS הם גורמים אבחון פרוגנוסטי חשוב Macroglobulinemia של Waldenström (WM), gammopathy מונוקלונלי IgM בעל משמעות לא ידוע (IgM-MGUS), לימפומה אזור שוליים הטחול (SMZL), מפוזר לימפומה B-cell גדול (DLBCL). מוטציות MYD88 נמצאים כמעט בכל המקרים של WM וכ 50% מהחולים עם אימונוגלובולין M (IgM) -secreting MGUS. וחשוף, מוטציות MYD88 נמצאות רק 0-6% מחולים עם SMZL ו נעדרות מיאלומה נפוצה ^{7, 8.} מכיוון מורפולוגיים חופפים, immunophenotypic, ציטוגנטית, ואת המאפיינים הקליניים בין WM ו- SMZL או מיאלומה נפוצה-IgM יכול לעתים קרובות לסבך אבחנות דיפרנציאלי, בנוכחות מוטציה MYD88 עשוי לשמש כגורם ⁹ זיהוי שימושי. מוטציות MYD88 גם קושרו עם נטל המחלה יותר בחולים עם DLBCL והישרדות כוללת עניים לאחר טיפול ^7, </sup> ^10. בנוסף, בגלל מוטציות MYD88 נמצאים בתדירות גבוהה יותר B-cell-like מופעל (ABC) DLBCL מ מרכז נבטי B-cell-like (GCB) DLBCL או לימפומה B-cell mediastinal העיקרי (PMBL), מצב המוטציה MYD88 עשויה לשמש סמן פונדקאי עבור תת ABC ^{11, 12.}

הפרוטוקול המפורט הניתן כאן משמש כתבנית שממנו המבחנים חדשים ניתן לפתח או ברוב מבחני רצף הקיימים ניתן להתאים בקלות לזהות מוטציות בתדירות נמוכות במדויק סוגים שונים מדגמים. הגישה יכולה לשמש גם עבור ניטור ואיתור מוטציות עמידות שעשויות להתפתח גידולים או אפילו חיידקים שעלולים להתפתח תוך חולי מטופלים עם טיפול ממוקד או אנטיביוטיקה. יתר על כן, היא מתייחסת ותרופות רבות מהבעיות הקשורות להעשרת מוטציה, במיוחד משובץ-פרפין קבוע פורמלין (FFPE) רקמות.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הבדיקה של דגימות אנושיות בוצעה לאחר קבלת אישור דירקטוריון הסקירה המוסדית (IRB). 1. הפקת DNA מרקמות FFPE, דם היקפי, מח עצם לשאוב עבור רקמות FFPE מח עצם עם ערכת חילוץ DNA FFPE <ol style…

Representative Results

סקירה מושגית של WTB-PCR במהלך ההארכה מוצגת באיור 1. בגלל חוסר התאמה של נוקלאוטיד יחיד ההיברידי החוסם-DNA מקטינה טמפרטורת ההתכה שלה מאוד (ΔT מ = 20 – 30 מעלות צלזיוס), הגברה של אלל WT חסום בזמן DNA תבנית מוטציה אינה כרוכה בתשלום כדי להשלים ארכה <sup clas…

Discussion

את assay WTB-PCR המתואר כאן משתמשת בסדרה הגנרית של פריימרים עם אוליגו חסימת נועד לחסום הגברה של DNA WT במהלך הארכה (איור 1). מוצר WTB-PCR הוא רצף אז עבור ניתוח מוטאציות. כלי השירות של WTB-PCR / סאנגר טמון בפשטותה, רגישות גבוהה, ו-תפוקה גבוהה. באמצעות ההנחיות המתוארות כאן, רוב מב…

Materials

1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes	Eppendorf	05-402-25
100% alcohol	VWR	89370-084	Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol
3730XL sequencer	ABI		or equivalent
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	For magnetic bead PCR purification
Aluminum sealing foils	GeneMate	T-2451-1	For PCR and cold storage
BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit	Life Technologies	4337455	For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer
Centrifuge 5804 Series	Eppendorf		A-2-DWP rotor (for PCR plate)
Cold plate for 96 well plates	Eppendorf	Z606634
DNAse, RNAse-free, ultra-pure water
dNTPs (100mM)	Invitrogen	10297-117
DynaMag-96 Side-Skirted Magnet	Thermo Fisher Scientific	12027	For use in PCR Purification.
Ethanol Absolute	Sigma	E7023	200 proof, for molecular biology
Exiqon website Oligo Tools			www.exiqon.com/oligo-tools
FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul)	Roche	12032937001	With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2
Gel electrophoresis apparatus			2% agarose gel
GeneRead DNA FFPE extraction Kit	Qiagen	180134	Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts
Hi-Di Formamide	ABI	4311320	For sequencing.
LNA oligonucleotide	Exiqon	500100	5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases)
M13-F Sequencing Primer	ABI		5'-tgt aaa acg acg gcc agt
M13-R Sequencing Primer	ABI		5'-cag gaa aca gct atg acc
Mastercycler Pro S Thermocycler	Eppendorf	E950030020
Microcentrifuge Model 5430	Eppendorf		FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes)
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific
PCR forward primer	IDT		5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG
PCR reverse primer	IDT		5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA
PCR plates	GeneMate	T-3107-1
Pipettors			20, 200, 1000 µl
Plate septa, 96 well	ABI	4315933
QIAamp DNA Mini Kit	Qiagen	51304	For BM aspirate and peripheral blood
SeqScape Sortware v3.0	ABI	4474978	For sequencing analysis
Slide basket
Sodium Acetate (3M, pH 5.2)	Sigma	S7899
Sterile filtered pipette tips			20, 200, 1000 µl
Thermomixer C	Eppendorf	5382000023
Vortex genie	Scientific Industries	SI-0236
Wash reservoir			~1000 ml
Xylene	VWR	89370-088	Histology grade