जंगली प्रकार अवरुद्ध पीसीआर कम आवृत्ति दैहिक उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए एक अति संवेदनशील विधि के रूप में प्रत्यक्ष अनुक्रमण के साथ संयुक्त
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
सटीक पता लगाने और कम आवृत्ति म्यूटेशन की पहचान समस्याग्रस्त जब उपचार के बाद अवशिष्ट रोग का आकलन करने, उपचार के दौरान प्रतिरोध उत्परिवर्तन उभरते के लिए स्क्रीनिंग हो सकता है, या रोगियों कुछ घूम ट्यूमर कोशिकाओं है जब। जंगली प्रकार अवरुद्ध पीसीआर अनुक्रमण विश्लेषण के बाद इन कम आवृत्ति म्यूटेशन का पता लगाने के लिए एक पद्धति के रूप में उच्च संवेदनशीलता, लचीलापन, और सरलता प्रदान करता है। एक कस्टम एक नया या पहले से स्थापित पारंपरिक पीसीआर आधारित अनुक्रमण परख करने के लिए न्यूक्लिक एसिड oligonucleotide बंद कर दिया तैयार किया गया जोड़कर, 1000 WT जेनेटिक तत्व की पृष्ठभूमि में लगभग 1 उत्परिवर्ती एलील की संवेदनशीलता प्राप्त किया जा सकता (1: 1,000)। अनुक्रमण deamination घटनाओं के साथ जुड़े कलाकृतियों सामान्यतः formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतकों में पाया आंशिक रूप से निकासी चरणों के दौरान uracil डीएनए glycosylase के उपयोग के द्वारा ठीक किया जा सकता है। अनुकूलित प्रोटोकॉल यहाँ MYD88 उत्परिवर्तन का पता लगाने के लिए विशिष्ट है, लेकिन किसी भी डिजाइन करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा कर सकतेWTB पीसीआर परख। एलील विशिष्ट पीसीआर और वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर झूठे सकारात्मक के कम पाया जाना, अधिक लचीलापन और कार्यान्वयन में आसानी शामिल सहित कम आवृत्ति परिवर्तन के पता लगाने के लिए अन्य सामान्य रूप से उपयोग किया assays से अधिक WTB पीसीआर परख के लाभ, और दोनों ज्ञात पता लगाने की क्षमता और अज्ञात म्यूटेशन।
Introduction
सेंगर अनुक्रमण पारंपरिक रूप से दोनों ज्ञात और अज्ञात दैहिक उत्परिवर्तन के लिए परीक्षण में स्वर्ण मानक किया गया है। सेंगर अनुक्रमण की सीमाओं में से एक का पता लगाने की अपनी सीमा है (~ 10 – WT की पृष्ठभूमि में 20% उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी) 1। संवेदनशीलता का यह स्तर निम्न स्तर दैहिक उत्परिवर्तन कि कुछ घूम ट्यूमर कोशिकाओं, या जब अस्थि मज्जा (बीएम) विचित्र है साथ premalignant ऊतकों या रोगियों से नमूनों में मौजूद हो सकता है पता लगाने के लिए अनुचित है। यह भी उपचार के बाद अवशिष्ट रोग का आकलन करने या अकेले 2 पारंपरिक अनुक्रमण द्वारा कठिन उपचार के दौरान विकसित प्रतिरोधक क्षमता के म्यूटेशन का पता लगाने में आता है। बंद न्यूक्लिक एसिड (LNA) के साथ पारंपरिक पीसीआर बदलकर जंगली प्रकार सेंगर अनुक्रमण में पीसीआर (WTB पीसीआर) को अवरुद्ध मध्यस्थता, WT की पृष्ठभूमि में अप करने के लिए 0.1% उत्परिवर्ती एलील की संवेदनशीलता 2, 3, 4 प्राप्त किया जा सकता। में(- 14 NT ~ 10) को अवरुद्ध (LNA) oligonucleotide कि WT डीएनए के WT डीएनए जिससे रोकने प्रवर्धन के लिए प्राथमिक रूप से बांधता है WTB पीसीआर, उत्परिवर्ती युग्मविकल्पी के लिए संवर्धन एक छोटी के अलावा के माध्यम से हासिल की है। उत्परिवर्ती समृद्ध WTB पीसीआर उत्पाद तो अनुक्रम जा सकता है। WT डीएनए को अवरुद्ध करने के बजाय विशिष्ट म्यूटेशन के लिए चयन करके WTB पीसीआर मिनट सेल अंशों में मौजूद दोनों ज्ञात और अज्ञात म्यूटेशन के संवर्धन के लिए अनुमति देता है।
एकाधिक तरीकों वर्तमान में छोटे कोशिकाओं अंशों में परिवर्तन का पता लगाने के लिए किया जाता है। इस एलील विशिष्ट पीसीआर, प्रवर्धन-दुर्दम्य उत्परिवर्तन प्रणाली (हाथों), उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (DHPLC), मोती, इमल्शन, प्रवर्धन, और आकर्षणविद्या (प्रसारित), बिजली के क्षेत्र प्रेरित जारी है और माप (EFIRM) denaturing, उच्च संकल्प भी शामिल है गलनांक और अन्य। हालांकि, इन तरीकों में से सबसे झूठी सकारात्मक और केवल एक ही उत्परिवर्तन कि परख 4 के लिए डिजाइन किया गया था पता लगाने की क्षमता द्वारा सीमित हैं </sup>। WTB पीसीआर, तथापि, अनुक्रमण निशान है जो कई उत्परिवर्तन प्रकार का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है और कलाकृतियों या deamination घटनाओं के कारण झूठे सकारात्मक को खारिज करने में सहायता कर सकते हैं कल्पना करने के लिए अनुमति देता है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (NGS) पारंपरिक अनुक्रमण के लिए एक उपयुक्त विकल्प की पेशकश कर सकते हैं, हालांकि, काफी हद तक अधिक से अधिक लागत, जटिलता, और लंबे समय तक परख समय यह कुछ अलग आणविक मार्कर के साथ कई रोग प्रकार के लिए या उभरते के लिए चिकित्सा पर रोगियों की निगरानी के लिए एक अनावश्यक विकल्प प्रस्तुत करना प्रतिरोध उत्परिवर्तन। 5% से कम की उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी आवृत्तियों के साथ इसके अलावा, उच्च मिथ्या सकारात्मक दरों जब पता लगाने वेरिएंट amplicon आधारित NGS 5 के लिए एक समस्या पैदा कर सकते हैं, 6।
यहाँ हम के रूप में Albitar एट अल द्वारा वर्णित माइलॉयड भेदभाव कारक 88 जीन में परिवर्तन के लिए स्क्रीनिंग में WTB पीसीआर द्वारा प्राप्त संवेदनशीलता में वृद्धि का प्रदर्शन। 3 MYD88 mutatioएनएस Waldenström के Macroglobulinemia (WM) अज्ञात महत्व (आईजीएम-MGUS) की, आईजीएम मोनोक्लोनल gammopathy, प्लीहा सीमांत क्षेत्र लिंफोमा (SMZL) में महत्वपूर्ण निदान और शकुन कारकों कर रहे हैं, और बड़े बी कोशिका लिंफोमा (DLBCL) फैलाना। MYD88 म्यूटेशन WM के लगभग सभी मामलों और इम्युनोग्लोबुलिन एम (आईजीएम) MGUS -secreting के साथ रोगियों के लगभग 50% में पाए जाते हैं। इसके विपरित्त MYD88 म्यूटेशन SMZL के साथ रोगियों के केवल 0-6% में पाया जाता है और एकाधिक myeloma 7, 8 में अनुपस्थित रहे हैं कर रहे हैं। क्योंकि ओवरलैपिंग शब्द के भागों, immunophenotypic, सितोगेनिक क, और WM और SMZL या आईजीएम-एकाधिक myeloma अक्सर विभेदक निदान को मुश्किल कर सकते हैं के बीच नैदानिक विशेषताओं, एक MYD88 उत्परिवर्तन की उपस्थिति एक उपयोगी की पहचान कारक 9 के रूप में काम कर सकते हैं। MYD88 म्यूटेशन भी चिकित्सा 7 निम्नलिखित DLBCL और गरीब समग्र अस्तित्व के साथ रोगियों में अधिक से अधिक इस बीमारी के बोझ के साथ संबद्ध किया गया है </sup> 10। इसके अलावा, MYD88 म्यूटेशन अधिक बार सक्रिय बी कोशिका की तरह (एबीसी) से DLBCL में पाए जाते हैं कीटाणु केंद्र बी कोशिका की तरह (GCB) DLBCL या प्राथमिक mediastinal बी कोशिका लिंफोमा (PMBL), MYD88 उत्परिवर्तन स्थिति एक के रूप में सेवा कर सकता है एबीसी उप प्रकार 11, 12 के लिए किराए की मार्कर।
विस्तृत यहाँ प्रदान प्रोटोकॉल एक टेम्पलेट है जहाँ से नई assays विकसित किया जा सकता है या सबसे मौजूदा अनुक्रमण assays आसानी से सही रूप में विभिन्न नमूना प्रकार में कम आवृत्ति म्यूटेशन पता लगाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में कार्य करता है। दृष्टिकोण भी निगरानी और प्रतिरोधी म्यूटेशन कि ट्यूमर या यहाँ तक कि बैक्टीरिया है कि जब तक रोगियों लक्षित चिकित्सा या एंटीबायोटिक दवाओं के साथ इलाज किया जा रहा है विकास हो सकता है में विकसित हो सकता है पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। इसके अलावा, यह संबोधित करते हैं और विशेष रूप से formalin निर्धारित पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतकों में, उत्परिवर्तन संवर्धन के साथ जुड़े कई मुद्दों को उपचार।
Protocol
Representative Results
Discussion
WTB पीसीआर परख यहाँ वर्णित विस्तार (चित्रा 1) के दौरान WT डीएनए के प्रवर्धन ब्लॉक करने के लिए तैयार किया गया एक अवरुद्ध oligo साथ प्राइमरों की एक सामान्य सेट का उपयोग करता। WTB पीसीआर उत्पाद तो उत्परिवर्त?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
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