低周波体細胞変異の検出のための高感度な方法として直接配列決定と組み合わせるPCRをブロックする野生型
Summary
Wild-type blocking PCR followed by direct sequencing offers a highly sensitive method of detection for low frequency somatic mutations in a variety of sample types.
Abstract
治療、治療中に耐性変異を出現するためのスクリーニング、または場合患者が少数の循環腫瘍細胞を有していた後に残存病変を評価する場合、低周波変異の正確な検出と識別が問題となり得ます。配列決定分析に続くPCRブロッキング野生型は、これらの低周波数の変異を検出するための方法として、高感度、柔軟性、および単純さを提供しています。新しいまたは以前に確立された従来のPCRに基づく配列決定アッセイにカスタム設計されたロックされた核酸、オリゴヌクレオチドを添加することにより、1000個のWT対立遺伝子のバックグラウンドで約1変異対立遺伝子の感度は、（1,000 1）を達成することができます。一般的に、ホルマリン固定パラフィン包埋組織で見出さ脱アミノ化イベントに関連付けられたシーケンシングアーチファクトが部分的に抽出工程中のウラシルDNAグリコシラーゼを使用することによって改善することができます。ここで最適化されたプロトコルは、MYD88の変異を検出するための具体的であるが、任意のを設計するためのテンプレートとして機能することができWTB-PCRアッセイ。対立遺伝子特異的PCR及びリアルタイム定量PCRを含む低頻度変異の検出のための他の一般的に利用されるアッセイオーバーWTB-PCRアッセイ法の利点は、偽陽性の少ない発生、柔軟性と実装の容易さ、および検出する能力を含む既知の両方および未知の変異。
Introduction
サンガー配列決定は、伝統的に、既知および未知の体細胞変異の検査でゴールドスタンダードとなっています。 （ – WTのバックグラウンド中の20％の変異対立〜10）1サンガー配列決定の制限の1つは、検出の限界です。感度のこのレベルは、いくつかの循環腫瘍細胞、又は骨髄（BM）は、斑状のときと前悪性組織または患者からの試料中に存在し得る低レベルの体細胞変異を検出するためには不適切です。これはまた、治療後の残存疾患を評価する単独2従来の配列決定により困難な治療中に新たな耐性変異を検出することができます。ロックされた核酸（LNA）と、従来のPCRを置き換えることによって、サンガー配列決定にPCR（WTB-PCR）をブロックする野生型の媒介、WTの背景で最大0.1％突然変異対立遺伝子の感度は、2、3、4を達成することができます。にこれにより、WT DNAの増幅を防止WT DNAに優先的に結合する（LNA）、オリゴヌクレオチドをブロック – （14 NT〜10）WTB-PCRは、変異体対立遺伝子について富化は短いの添加を介して達成されます。変異体富化WTB-PCR産物は、次いで、配列決定することができます。 WT DNAを遮断ではなく、特定の変異について選択することによってWTB-PCRは、微小細胞画分中に存在する既知および未知の変異の濃縮を可能にします。
複数の方法は、現在、小細胞画分における変異を検出するために使用されます。これは、高速液体クロマトグラフィー（DHPLC）、ビーズ、エマルジョン、増幅、および磁気（のBEAMing）、電界誘起放出および測定（EFIRM）、高分解能変性、対立遺伝子特異的PCR、増幅不応性変異システム（ARMS）を含みます融点など。しかし、これらの方法のほとんどは偽陽性とのみアッセイは4のために設計された一つの変異を検出する能力によって制限されています</SUP>。 WTB-PCRは、しかし、ユーザが複数の変異型の検出を可能にし、成果物または脱アミノ化の事象による偽陽性を除外するのを助けることができるシーケンシングトレースを視覚化することができます。次世代シーケンシング（NGS）が、実質的に大きなコスト、複雑さ、及びより長いアッセイ時間はそれをいくつかの異なる分子マーカーを有する多くの疾患の種類または新興のための治療を受けている患者を監視するための不要なオプションをレンダリング、従来の配列決定に適切な代替を提供することができます耐性変異。さらに、高い偽陽性率が5％未満の変異対立遺伝子頻度を有する変異体を検出した場合は、アンプリコンベースのNGS 5、6のための問題を提起することができます。
ここでは、Albitar らによって記載されているように骨髄分化因子88遺伝子の突然変異のスクリーニングにWTB-PCRによって達成感度の増加を示します。 3 MYD88のmutatioNSは、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症（WM）未知の重要性（IgMでMGUS）の、IgMモノクローナル免疫グロブリン血症、脾臓辺縁帯リンパ腫（SMZL）における重要な診断および予後因子であり、大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）を拡散します。 MYD88の変異は、WMとMGUSを分泌する免疫グロブリンM（IgM抗体）の患者の約50％のほぼすべてのケースで発見されました。対照的に、MYD88突然変異はSMZL患者の唯一の0から6パーセントに見られ、多発性骨髄腫7,8に存在しないされています。重複形態学、免疫表現型、細胞遺伝学的、およびWM及びSMZL又はIgM、多発性骨髄腫との間の臨床的特徴は、多くの場合、鑑別診断を複雑にすることができるので、MYD88変異の存在は、有用な同定因子9として機能することができます。 MYD88の変異はまた、治療7次DLBCLと貧しい全体的な生存患者においてより大きな疾病負担と関連しています</SUP> 10。また、MYD88突然変異はより頻繁に活性化B細胞様（ABC）DLBCLで発見されているのでBが細胞様（GCB）DLBCLまたは原発性縦隔B細胞リンパ腫（PMBL）、MYD88の変異状態として働くことができる胚中心ABCサブタイプ11、12の代理マーカー。
ここで提供される詳細なプロトコルは、新しいアッセイを開発することができるか、またはほとんどの既存の配列決定アッセイを容易に正確に様々な試料タイプにおける低頻度変異を検出するように構成することが可能なテンプレートとして役立ちます。アプローチはまた、モニタリング及び腫瘍または患者は標的療法または抗生物質で治療されている間に発生することがあっても、細菌で発症し得る耐性変異を検出するために使用することができます。さらに、それは特にホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）組織では、変異濃縮に関連する問題の多くに対処し、救済。
Protocol
Representative Results
Discussion
WTB-PCRアッセイは、ここで説明する拡張（ 図1）の間にWT DNAの増幅をブロックするように設計されたブロッキングオリゴプライマーの一般的なセットを使用します。 WTB-PCR産物は、次いで、変異解析のために配列決定されます。 WTB-PCR /サンガーの有用性は、その単純性、高感度、高スループットです。ここで説明するガイドラインを使用して、ほとんどの既存のサンガーベースの?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| 1.5 or 2 ml Safe-Lock microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05-402-25 | |
| 100% alcohol | VWR | 89370-084 | Histology grade; 91.5% Ethanol, 5% Isopropyl alcohol, 4.5% Methyl alcohol |
| 3730XL sequencer | ABI | or equivalent | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | For magnetic bead PCR purification |
| Aluminum sealing foils | GeneMate | T-2451-1 | For PCR and cold storage |
| BigDye Terminator v3.1 Cycle sequencing kit | Life Technologies | 4337455 | For bi-directional sequencing. With 5X Sequencing Buffer |
| Centrifuge 5804 Series | Eppendorf | A-2-DWP rotor (for PCR plate) | |
| Cold plate for 96 well plates | Eppendorf | Z606634 | |
| DNAse, RNAse-free, ultra-pure water | |||
| dNTPs (100mM) | Invitrogen | 10297-117 | |
| DynaMag-96 Side-Skirted Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | For use in PCR Purification. |
| Ethanol Absolute | Sigma | E7023 | 200 proof, for molecular biology |
| Exiqon website Oligo Tools | www.exiqon.com/oligo-tools | ||
| FastStart Taq DNA polymerase (5 U/ul) | Roche | 12032937001 | With10X concentrated PCR reaction buffer, with 20 mM MgCl2 |
| Gel electrophoresis apparatus | 2% agarose gel | ||
| GeneRead DNA FFPE extraction Kit | Qiagen | 180134 | Contains uracil DNA glycosylase necessary for reducing sequencing artifacts |
| Hi-Di Formamide | ABI | 4311320 | For sequencing. |
| LNA oligonucleotide | Exiqon | 500100 | 5'-TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/ (+N = LNA bases) |
| M13-F Sequencing Primer | ABI | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt | |
| M13-R Sequencing Primer | ABI | 5'-cag gaa aca gct atg acc | |
| Mastercycler Pro S Thermocycler | Eppendorf | E950030020 | |
| Microcentrifuge Model 5430 | Eppendorf | FA-45-30-11 rotor (for 1.5/2 ml microcentrifuge tubes) | |
| NanoDrop 2000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| PCR forward primer | IDT | 5'-tgt aaa acg acg gcc agt TGC CAG GGG TAC TTA GAT GG | |
| PCR reverse primer | IDT | 5'-cag gaa aca gct atg acc GGT TGG TGT AGT CGC AGA CA | |
| PCR plates | GeneMate | T-3107-1 | |
| Pipettors | 20, 200, 1000 µl | ||
| Plate septa, 96 well | ABI | 4315933 | |
| QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen | 51304 | For BM aspirate and peripheral blood |
| SeqScape Sortware v3.0 | ABI | 4474978 | For sequencing analysis |
| Slide basket | |||
| Sodium Acetate (3M, pH 5.2) | Sigma | S7899 | |
| Sterile filtered pipette tips | 20, 200, 1000 µl | ||
| Thermomixer C | Eppendorf | 5382000023 | |
| Vortex genie | Scientific Industries | SI-0236 | |
| Wash reservoir | ~1000 ml | ||
| Xylene | VWR | 89370-088 | Histology grade |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. Digital PCR. Proc Natl Acad of Sci U S A. 96 (16), 9236-9241 (1999).
- Milbury, C. A., Li, J., Makrigiorgos, G. M. PCR-based methods for the enrichment of minority alleles and mutations. Clin Chem. 55 (4), 632-640 (2009).
- Albitar, A., Ma, W., DeDios, I., Estella, J., Agersborg, S., Albitar, M. Positive selection and high sensitivity test for MYD88 mutations using locked nucleic acid. Int J Lab Hematol. 38 (2), 133-140 (2016).
- Dominguez, P. L., Kolodney, M. S. Wild-type blocking polymerase chain reaction for detection of single nucleotide minority mutations from clinical specimens. Oncogene. 24 (45), 6830-6834 (2005).
- Gray, P. N., Dunlop, C. L. M., Elliott, A. M. Not All Next Generation Sequencing Diagnostics are Created Equal: Understanding the Nuances of Solid Tumor Assay Design for Somatic Mutation Detection. Cancers. 7 (3), 1313-1332 (2015).
- Smith, E. N., et al. Biased estimates of clonal evolution and subclonal heterogeneity can arise from PCR duplicates in deep sequencing experiments. Genome Biol. 15 (8), 420 (2014).
- Varettoni, M., et al. Prevalence and clinical significance of the MYD88 (L265P) somatic mutation in Waldenström’s macroglobulinemia and related lymphoid neoplasms. Blood. 121 (13), 2522-2528 (2013).
- Xu, L., et al. MYD88 L265P in Waldenström macroglobulinemia, immunoglobulin M monoclonal gammopathy, and other B-cell lymphoproliferative disorders using conventional and quantitative allele-specific polymerase chain reaction. Blood. 121 (11), 2051-2058 (2013).
- Gertz, M. A. Waldenström macroglobulinemia: 2012 update on diagnosis, risk stratification, and management. Amer J Hematol. 87 (5), 503-510 (2012).
- Salar, A., et al. MYD88 (L265P) Mutation Confers Very Poor Response and Outcome after Second-Line Therapy in Patients with Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL). Blood. 124 (21), 1690-1690 (2014).
- Ngo, V. N., et al. Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature. 470 (7332), 115-119 (2011).
- Pasqualucci, L., et al. Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma. Nat Genet. 43 (9), 830-837 (2011).
- Dieffenbach, C., Lowe, T., Dveksler, G. General concepts for PCR primer design. PCR Methods Appl. 3 (3), S30-S37 (1993).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Applied Biosystems. . User Guide for Applied Biosystems 3730/3730xl DNA Analyzer. , (2014).
- Applied Biosystems. . User Guide for SeqScape Software 3. , (2012).
- Mouritzen, P., Nielsen, A. T., Pfundheller, H. M., Choleva, Y., Kongsbak, L., Møller, S. Single nucleotide polymorphism genotyping using locked nucleic acid (LNA). Expert Rev Mol Diagn. 3 (1), 27-38 (2003).
- Quach, N., Goodman, M. F., Shibata, D. In vitro mutation artifacts after formalin fixation and error prone translesion synthesis during PCR. BMC Clin Pathol. 4 (1), (2004).
- Gallegos Ruiz, M. I., Floor, K., Rijmen, F., Grünberg, K., Rodriguez, J. A., Giaccone, G. EGFR and K-ras mutation analysis in non-small cell lung cancer: comparison of paraffin embedded versus frozen specimens. Anal Cell Pathol. 29 (3), 257-264 (2007).
- Solassol, J., et al. KRAS mutation detection in paired frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) colorectal cancer tissues. Int J Mol Sci. 12 (5), 3191-3204 (2011).
- Yost, S. E., et al. Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Res. 40 (14), e107-e107 (2012).
- Do, H., Wong, S. Q., Li, J., Dobrovic, A. Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clin Chem. 59 (9), 1376-1383 (2013).
- Oldenburg, R. P., Liu, M. S., Kolodney, M. S. Selective amplification of rare mutations using locked nucleic acid oligonucleotides that competitively inhibit primer binding to wild-type DNA. J Invest Dermatol. 128 (2), 398-402 (2008).
- Mancini, M., et al. Two novel methods for rapid detection and quantification of DNMT3A R882 mutations in acute myeloid leukemia. J Mol Diagn. 17 (2), 179-184 (2015).
- Parsons, B. L., Heflich, R. H. Genotypic selection methods for the direct analysis of point mutations. Mutat Res Rev Muta Res. 387 (2), 97-121 (1997).
- Liu, Q., Swiderski, P., Sommer, S. S. Truncated amplification: a method for high-fidelity template-driven nucleic acid amplification. BioTechniques. 33 (1), 129-139 (2002).
- Kaur, M., Zhang, Y., Liu, W. H., Tetradis, S., Price, B. D., Makrigiorgos, G. M. Ligation of a primer at a mutation: a method to detect low level mutations in DNA. Mutagenesis. 17 (5), 365-374 (2002).
- Albitar, A., et al. High Sensitivity Testing Shows Multiclonal Mutations in Patients with CLL Treated with BTK Inhibitor and Lack of Mutations in Ibrutinib-Naive Patients. Blood. 126 (23), 716 (2015).
