غير الغازية<em> في فيفو</em> الإسفار التصوير البصري من مب النشاط التهابات باستخدام عامل التصوير الفلورسنت أكتيفاتابل
Summary
هذه الورقة يفسر تطبيق التصوير الفلورسنت باستخدام مسبار التصوير الضوئي أكتيفاتابل لتصور النشاط في الجسم الحي من ميتالوبروتيناسس المصفوفة الرئيسية في اثنين من نماذج تجريبية مختلفة من الالتهاب.
Abstract
تصف هذه الورقة طريقة غير الغازية لتصوير المصفوفة ميتالوبروتيناسيس (مب) – النشاط من قبل التحقيق الفلورسنت أكتيفاتابل، عبر في الجسم الحي مضان التصوير البصري (أوي)، في اثنين من نماذج الماوس المختلفة من الالتهاب: التهاب المفاصل الروماتويدي (را) والاتصال فرط الحساسية رد فعل (شر) نموذج. ضوء مع الطول الموجي في الأشعة تحت الحمراء القريبة (نير) نافذة (650 – 950 نانومتر) يسمح اختراق أعمق الأنسجة والحد الأدنى من امتصاص إشارة مقارنة أطوال موجية أقل من 650 نانومتر. المزايا الرئيسية باستخدام مضان أوي هو أنها رخيصة وسريعة وسهلة التنفيذ في نماذج حيوانية مختلفة.
أكتيفاتابل تحقيقات الفلورسنت صامتة بصريا في الدول المعطل لها، ولكن تصبح الفلورسنت عالية عند تفعيلها من قبل الأنزيم البروتيني. تنشيط مبس تؤدي إلى تدمير الأنسجة وتلعب دورا هاما لتطور المرض في تأخر من نوع فرط الحساسية ردود الفعل (دثرس) مثل را و شر. وعلاوة على ذلك، مبس هيوالبروتياز الرئيسية للغضروف وتدهور العظام والتي تتسبب فيها الضامة، الخلايا الليفية والغضروفية استجابة للسيتوكينات الموالية للالتهابات. هنا نستخدم مسبار التي يتم تنشيطها من قبل مبس الرئيسية مثل مب-2، -3، -9 و -13 ووصف بروتوكول التصوير لمؤشر الأشعة تحت الحمراء القريب مضان أوي نشاط مب في را والسيطرة على الفئران بعد 6 أيام من تحريض المرض كذلك كما هو الحال في الفئران مع الحاد (التحدي 1X) والمزمنة (5X التحدي) شر على الأذن اليمنى مقارنة مع آذان صحية.
Introduction
تصنف أمراض المناعة الذاتية مثل التهاب المفاصل الروماتيزمي (RA) أو الشائع الصدفية كما من نوع تأخر تفاعلات فرط الحساسية (DTHRs). 1 RA هو مرض المناعة الذاتية شيوعا التي تتميز الزليل التآكل والتدمير المشترك. 2 التهاب المفاصل الملتهبة تثبت تسلل وانتشار خلايا التهابية، وزيادة التعبير الخلايا الموالية للالتهابات مما يؤدي إلى تشكيل متقطعة مزنية والغضاريف والعظام التدمير. 3، 4 انشقاق من جزيئات المصفوفة خارج الخلية، مثل مادة الكولاجين مصفوفة metalloproteinases (تقوم ال MMPs)، أمر ضروري لتحويل الأنسجة والأوعية الدموية ويسبب دمار الأنسجة. تتميز 5، 6 الاتصال فرط الحساسية ردود الفعل (لجنة حقوق الإنسان) من خلال تجميع العدلات مما يؤدي إلى انفجار الأكسدة. 7 على غرار RA، تقوم ال MMPs في لجنة حقوق الإنسان هي involفيد في تحويل الأنسجة، وهجرة الخلايا والأوعية الدموية من أجل إقامة التهاب مزمن.
للتحقيق RA، تم استخدام إيزوميراز الجلوكوز 6 فوسفات (GPI) حقن -serum نموذج الفأر. 8 من الأمصال المعدلة وراثيا الفئران K / BXN تحتوي على أجسام مضادة ضد GPI، تم حقنها ساذجة الفئران BALB / ج وبعد ذلك بدأ التهاب الروماتيزم لتطوير خلال 24 ساعة بحد أقصى من تورم الكاحل في يوم 6 بعد حقن GPI المصل (انظر 1.1). لتحليل CHR المزمن، وتوعية C57BL / 6 الفئران مع trinitrochlorobenzene (TNCB) على البطن. وطعن الأذن اليمنى تصل إلى 5 مرات بدءا 1 بعد أسبوع التوعية (انظر أيضا 1.1 و 1.2).
موسع OI الحيوانات الصغيرة هي تقنية تقوم على التحقيق في الجسم الحي من fluorescent-، chemiluminescent- وإضاءة الحيوية إشارات، والتي تستخدم أساسا في مجال البحوث قبل السريرية. البيانات نصف الكمية المكتسبة يعطي نظرة ثاقبة لmolecآليات ular في الأعضاء والأنسجة من صحية وكذلك نماذج تجريبية على الحيوانات المريضة، وتمكن طولية متابعة القياسات (على سبيل المثال لتقييم الشخصية الاستجابة العلاجية في الجسم الحي). وهناك ميزة كبيرة من الدراسات الطولية هي الحد من أعداد الحيوانات، كما يمكن قياس الحيوانات نفسها في متابعة الدراسات في عدة نقاط الوقت بدلا من استخدام الفئران مختلفة في نقطة زمنية. حل OI يسمح التصوير وظيفي مفصل لأجهزة وهياكل الأنسجة أصغر في حيوانات التجارب.
استخدام الإثارة وانبعاث المرشحات محددة مع مجموعة نقل الضيق، لتوفير الحماية ضد الضوء المتناثرة من قبل lightproof "مربع الظلام" وجهاز حساس اتهم جانب (CCD) وكاميرا، والتي يتم تبريد في العديد من الأجهزة وصولا الى -70 ° C ، ويسمح محددة للغاية والقياسات الحساسة من إشارات مضان.
باستخدام وكلاء الفلورسنت مع excitation- والانبعاثات الأطياف في إطار مضان القريب من الأشعة تحت الحمراء (650-950 نانومتر)، ونسب الإشارة إلى الضوضاء يمكن أن تحسن بشكل كبير. ويتميز نافذة مضان الأشعة تحت الحمراء القريبة من امتصاص منخفضة نسبيا من إشارة من الهيموجلوبين والمياه فضلا عن انخفاض الخلفية لصناعة السيارات في مضان. 9 وهذا ما يسمح عمق الاختراق تصل إلى 2 سم في أنسجة الحيوانات الصغيرة. يمكن OI-تحقيقات تتناول هدف مباشرة (مثلا عن طريق مضان الأجسام المضادة المسمى) أو يمكن تفعيلها في النسيج المستهدف (مثلا عن طريق البروتياز). تحقيقات منظمة اوكسفام الدولية Activatable صامتة بصريا في شكلها المعطل بسبب فورستر نقل الطاقة الرنين (الحنق) إلى شاردة التبريد، والذي ينقل الطاقة الإثارة داخل جزيء إلى مجال آخر. إذا تم المشقوق الصبغة (بواسطة الأنزيم البروتيني على سبيل المثال) لم يعد يتم نقل الطاقة في جزيء ويمكن الكشف عن إشارة الفلورسنت التي كتبها OI. وهذا يسمح للتصميم تحقيقات OI مع specificit عاليةذ لعمليات بيولوجية متميزة والضوضاء نسب الإشارة إلى ممتازة.
ويوضح البروتوكول التالية بالتفصيل إعداد الحيوانات، القياسات OI OI باستخدام مسبار Activatable إلى صورة MMP-2، -3، -9 -13 والنشاط في الجسم الحي واثنين من نماذج تجريبية من التهاب (RA، لجنة حقوق الإنسان).
Protocol
Representative Results
Discussion
أوي هو أداة مفيدة جدا وسريعة وغير مكلفة لغير الغازية في الجسم الحي التصوير الجزيئي في البحوث قبل السريرية. قوة معينة من أوي هو القدرة على رصد عمليات ديناميكية للغاية مثل الاستجابات الالتهابية. وعلاوة على ذلك، أوي يسمح واحد لمتابعة مسار المرض لفترة طويلة من الزم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر دانيال بوكالا، ناتالي ألتمير وفوندا كاي للدعم الفني الممتاز. نشكر جوناثان كوتن، جريج بودين وبول سوبيران لتحرير المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل شركة سيمنز-مؤسسة فيرنر وكلية الطب في جامعة توبنغن ايبرهارد كرلس ( '' Promotionskolleg '') والتي DFG من خلال CRC 156 (C3 المشروع).
Materials
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28×0.61mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | – | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | – | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | – | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100µl) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C. The K/BxN arthritis model. Curr Protoc Immunol. 15, 22 (2008).
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3′-deoxy-3′-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3′-deoxy-3′-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3′-[18F]fluoro-3′-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
