Summary
Dette papir forklarer anvendelsen af fluorescerende billeddannelse under anvendelse af et aktiverbart optisk billeddannelse probe at visualisere in vivo-aktiviteten af centrale matrixmetalloproteinaser i to forskellige forsøgsmodeller for inflammation.
Abstract
Dette papir beskriver en ikke-invasiv metode til billeddannelse af matrix-metalloproteinaser (MMP) -aktivitet ved hjælp af en aktiverbar fluorescerende probe via in vivo fluorescensoptisk billeddannelse (OI) i to forskellige musemodeller af inflammation: en reumatoid arthritis (RA) og en kontakt Overfølsomhedsreaktion (CHR) model. Lys med en bølgelængde i det nærliggende infrarøde (NIR) vindue (650-950 nm) muliggør en dybere vævspennetrækning og minimal signalabsorption sammenlignet med bølgelængder under 650 nm. De største fordele ved hjælp af fluorescens OI er, at det er billigt, hurtigt og nemt at implementere i forskellige dyremodeller.
Aktiverbare fluorescerende prober er optisk tavse i deres inaktiverede tilstande, men bliver stærkt fluorescerende, når de aktiveres af en protease. Aktiverede MMP'er fører til ødelæggelse af væv og spiller en vigtig rolle for sygdomsprogression i hypersensitivitetsreaktioner med forsinket type (DTHR'er) såsom RA og CHR. Endvidere er MMP'erde centrale proteaser til brusk- og knoglenedbrydning og fremkaldes af makrofager, fibroblaster og chondrocytter i afhængighed proinflammatoriske cytokiner. Her bruger vi en sonde, der aktiveres af de centrale MMP'er som MMP-2, -3, -9 og -13 og beskrive et billeddannende protokol for nær infrarød fluorescens OI af MMP-aktivitet i RA og kontrolmus 6 dage efter sygdomsinduktion samt som i mus med akut (1x udfordring) og kronisk (5x udfordring) CHR på højre øre i forhold til raske ører.
Introduction
Autoimmune sygdomme som reumatoid arthritis (RA) eller psoriasis vulgaris er klassificeret som hypersensitivitetsreaktioner med forsinket type (DTHR). 1 RA er en almindelig autoimmun sygdom præget af erosiv synovitis og ledd ødelæggelse. 2 inflamtrerede leddgiktskanaler viser infiltration og proliferation af inflammatoriske celler, et øget udtryk for proinflammatoriske celler, der fører til dannelse af pannus, brusk og knogleredbrydning. 3 , 4 Spaltningen af ekstracellulære matrixmolekyler, såsom kollagen ved matrixmetalloproteinaser (MMP'er), er essentiel for vævsomdannelse og angiogenese og forårsager vævsdestruktioner. 5 , 6 Kontakt overfølsomhedsreaktioner (CHR) er kendetegnet ved aggregering af neutrofiler, der fører til en oxidativ udbrud. 7 Ligesom RA er MMP'er i CHR involveretub i væv konvertering, cellevandring og angiogenese for at etablere kronisk inflammation.
At undersøge RA, blev glucose-6-phosphat-isomerase (GPI) -serum injektion musemodel anvendes. 8 Serum fra transgene K / BxN-mus, der indeholder antistoffer mod GPI, blev injiceret i naive BALB / c-mus, hvorefter reumatisk inflammation begyndte at udvikle sig inden for 24 timer med et maksimum på ankel hævelse på dag 6 efter GPI-serum injektion (se 1.1). At analysere kronisk CHR, blev C57BL / 6-mus sensibiliseret med trinitrochlorbenzen (TNCB) på maven. Det højre øre blev udfordret op til 5 gange startende 1 uge efter sensibilisering (se også 1.1 og 1.2).
Noninvasive lille dyr OI er en teknik baseret på in vivo undersøgelse af fluorescent-, chemiluminescent- og bioluminescerende-signaler, der hovedsagelig anvendes i præklinisk forskning. Den erhvervede semi-kvantitative data giver indsigt i, Molecular mekanismer i organer og væv fra raske såvel som syge eksperimentelle dyremodeller, og muliggør langsgående opfølgning målinger (f.eks at vurdere terapeutiske responsprofiler in vivo). En stor fordel af langsgående undersøgelser er reduktionen af antallet af dyr, som de samme dyr kan måles i opfølgende undersøgelser på flere tidspunkter i stedet for at bruge forskellige mus pr tidspunkt. Løsningen af OI tillader detaljeret funktionel billeddannelse af organer og endnu mindre vævsstrukturer i forsøgsdyr.
Anvendelsen af specifikke excitations- og emissionsfiltre med en smal transmissionsspektrum, en beskyttelse mod spredt lys ved en lystæt "mørk box" og en følsom Charge Coupled indretning (CCD) kamera, som afkøles i mange enheder ned til -70 ° C tillader meget specifikke og følsomme målinger af fluorescenssignaler.
Ved anvendelse af fluorescerende midler med excitations- ogEmissionsspektre i det nær-infrarøde fluorescensvindue (650-950 nm), kan signal-til-støjforholdene forbedres signifikant. Det nær-infrarøde fluorescensvindue er karakteriseret ved en relativt lav absorption af signalet med hæmoglobin og vand såvel som en lav baggrunds-auto-fluorescens. 9 Dette giver mulighed for en indtrængningsdybde på op til 2 cm i små dyrs væv. OI-prober kan adressere et mål direkte ( fx ved et fluorescensmærket antistof) eller kan aktiveres i målvævet ( f.eks. Ved proteaser). Aktiverbare OI-prober er optisk tavse i deres inaktiverede form på grund af Förster-resonansenergioverførslen (FRET) til en slukningsdel, som overfører excitationsenergien inden for molekylet til et andet domæne. Hvis farvestoffet spaltes (f.eks. Ved en protease) overføres energi ikke længere inden i molekylet, og et fluorescerende signal kan detekteres af OI. Dette gør det muligt at designe OI-prober med høj specifikationY for forskellige biologiske processer og fremragende signal-til-støj-forhold.
Den følgende protokol forklarer detaljeret fremstillingen af dyrene, OI-målingerne ved anvendelse af en aktiverbar OI-probe til billede MMP-2, -3, -9 og -13 aktivitet in vivo og to eksperimentelle modeller af inflammation (RA, CHR).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer beskrevet i dette papir fulgte retningslinjer og internationale standarder for pleje og brug af forsøgsdyr og blev godkendt af den lokale dyrevelfærd og etiske udvalg i landkommissionen Tuebingen, Tyskland. 8-12 uger gamle BALB / c og C57BL / 6 mus blev opbevaret i en 12 h: 12 h lys: mørk cyklus og blev anbragt i IVC'er og standardiserede miljøforhold ved 22 ± 1 ° C i grupper på 2-5 med vand og Adgang til mad ad libitum .
1. Materialepræparation
- Fortynd OI farvestoffet til nær infrarød fluorescens billeddannelse i henhold til det respektive datablad umiddelbart inden injektion. Det aktiverbare OI farvestof (kommerciel probe med en excitation ved 680 nm) til måling af MMP'er in vivo er klar til anvendelse i en koncentration på 20 nmol i 1,5 ml 1 x PBS. Ryst omhyggeligt eller vortex opløsningen inden brug. OI farvestof kan opbevares ved 2 - 8 ° C i op til 6 måneder, når det beskyttes mod lys. Til intravenøse ( iv ) injektioner fremstilles et venøst kateter. Brug en 20 U (0,5 ml) insulinsprøjte fyldt med 0,9% saltopløsning (indeholdende 10 injektionsenheder af heparin i 50 ml) og en 30 gauge nål fastgjort til et polyethylenkateter. Injicer den anbefalede dosis på 2 nmol pr. Mus af OI-farvestoffet.
2. Induktion af reumatoid arthritis og kronisk kontakt overfølsomhedsreaktion
- Rheumatoid arthritis:
- Fortynd 100 μl serum (opnået fra K / BxN mus 10 ) indeholdende antistoffer (AB) mod glucose-6-phosphatisomerase (GPI) 1: 1 med 1x PBS (200 μl) for at inducere RA. Opbevar det fortyndede serum ved -80 ° C. Detaljerede procedurer til induktion af RA er beskrevet af Monach et al. 8 .
- For at inducere RA skal man løfte hver mus forsigtigt ved halen og injicere 200 μL af det fortyndede serum intraperitoneale ( ip ) på dag 0 i than eksperimentere. Efter indsprøjtningen placere musen direkte tilbage i sit bur.
- Eventuelt måle ankel diametre hver ankel, før AB injektioner og definere en "arthritisk score" (figur 1A). Fortsæt måling af ankel hævelse dagligt indtil dag 6 efter GPI-serum ved anvendelse af en mekanisk måleindretning (mikrometer).
- Injicere den aktiverbare OI farvestof (trin 1.1 - 1.2), til at måle in vivo-MMP-aktivitet iv i halevenen af RA-mus på dag 5 efter GPI-serum injektion og i halevenen af kontrolmus. Udfør optisk billeddannelse eksperimenter 24 timer efter haleveneinjektion.
- Kontakt overfølsomhedsreaktion:
- For sensibilisering af C57BL / 6-mus, fremstilling af en 5% TNCB opløsning opløst i en 4: 1 blanding af acetone / olie.
- Bedøve C57BL / 6 mus ved anvendelse af 1,5% isofluran fordampet i 100% oxygen (1,5 liter / min). Når musene er bedøvet, læg den i en selvstændig gal E næsekegle (en skåret 5 ml polyethylensprøjte, forbundet med 1,5 vol% isofluranrøret) og opretholde bedøvelse. Påfør æterisk salve på bedøvede dyr for at forhindre tørhed af øjnene under bedøvelse.
- Barber maven forsigtigt (2 x 2 cm) ved hjælp af en lille dyrehår trimmer. Undgå at skade huden, da dette kan føre til uspecifikke fluorescerende signaler inden for dyret og kan påvirke resultaterne af undersøgelsen.
- Påfør 80 μL af 5% TNCB-opløsningen langsomt på det barberede abdomenområde ved hjælp af en 100 μL pipette for at sensibilisere dyret. Hold musen forsigtigt tilbage i buret og sørg for, at musens øjne ikke kommer i kontakt med strøelse for at undgå hornhindebeskadigelse og undgå lave kropstemperaturer under genoprettelsesfasen.
- Seks dage efter sensibilisering, lav en 1% TNCB opløsning (opløst i en 9: 1 blanding af acetone / olie) og påfør 20 μL ved højre øre ved hjælp af en pipette for at fremkalde akut og kronisk CHSR."> 1
- Start med den 1. udfordring på begge sider af højre øre med 20 μL 1% TNCB opløsning ved hjælp af en 100 μL pipette og gentag udfordringen hver anden dag op til fem gange (dag 15 efter sensibilisering) for at fremkalde CHR ( Figur 1B ) . Mål øretykkelse dagligt ved hjælp af en mikrometer måleenhed.
- Injicer det aktiverbare OI farvestof (en kommerciel probe med excitation ved 680 nm) (trin 1.1-1.2) til måling af MMP-aktivitet in vivo i CHR-mus 12 timer efter udfordringen. Udfør optiske billeddannelseseksperimenter 24 timer efter injektion i halevenen ( iv ).
3. Dyreforberedelse til optisk billeddannelse
- Skift musekorn (mindst 3 dage før billeddannelse) til lav eller ikke-fluorescenschow ( fx manganfri) for at undgå interferens af auto-fluorescens (ca. 700 nm) med fluorescenssignalet for de anvendte OI-midler.
- Placer dyret iTil en anæstesi boks og bedøvelse ved anvendelse af 1,5 vol% isofluran fordampet med oxygen (1,5 l / min) (oxygen kan erstattes af luft, men skal standardiseres inden for et forsøg).
- Når musen er synligt bedøvet, placeres den i en selvfremstillet næse kegle (opbygget med en skåret 5 ml polyethylensprøjte, forbundet med 1,5 vol% isofluranrøret) og opretholder anæstesi.
- Barber dyret omhyggeligt på målstedet (2 cm x 2 cm) ved hjælp af en lille dyrehårstrimmer. Undgå at skade huden, da dette kan føre til uspecifikke fluorescerende signaler inden for dyret og kan påvirke resultaterne af undersøgelsen.
BEMÆRK: Hærer kan absorbere fluorescenssignalet under OI (afhængig af musestammen, mere eller mindre absorption observeres) afhængigt af regionens interesse (ROI). - Til iv- injektion skal du placere musens hale i varmt vand for at fremkalde vasodilation, rens huden forsigtigt på injektionsstedet med alkohol, og start med at placere kateteret vedDen distale side af halen. Placer nålens "skåret" kant i en vinkel på 20 ° i halevenen og test den korrekte placering af kateteret ved at suspendere sprøjten igen.
- Hvis kateteret er placeret korrekt, skal du udskifte sprøjten og injicere OI-sonden (2 nmol). Efter injektion skal du udskifte sprøjten og injicere 25 μL 0,9% saltvandsløsning for fuldstændigt at rydde det døde volumen af polyethylenrøret.
BEMÆRK: Vævhalveringstiden for det anvendte OI-farvestof (en kommerciel probe med excitation ved 680 nm) til måling af MMP-aktivitet in vivo er 72 timer. For at sikre en fuldstændig clearance, anbefales en injektion af farvestoffet ikke tidligere end 7 dage efter en forudgående injektion.
4. Optisk billeddannelse
- Placer et sort plastik eller papirark i den sorte boks i OI-scanneren midt i synsfeltet (FOV).
- Indstil en måleprotokol og vælg den rigtige bølgelængde (excitation: 680 ± 10 nm og emission: 700 ± 10 nm) og billedbehandling parametre.
BEMÆRK: I nogle OI systemer, opsætningen for flere imaging farvestoffer er foruddefineret. - For at vælge den korrekte protokol til fluorescens billeddannelse, åbner imaging software (leveret af producenten), og initialisere systemet. De fleste CCD-kameraer har brug for at køle ned til deres arbejdstemperatur, og dette kan tage 10 minutter. For pålidelige resultater, vente, indtil systemet er klar.
- Observere in vivo imaging system erhvervelse kontrolpanel dukker op og hvert filter valgte par vil repræsentere et billede i sekvensen. I dette tilfælde erhverve et billede med filterpar for kommercielle farvestof med og en excitations- og emissionsbølgelængde på 680 ± 10 nm og 700 ± 10 nm, og start målingen (Tryk "Acquire sekvens"). For mere detaljerede instruktioner, se venligst manualen fra producenten.
- Mærk billederne hensigtsmæssigt og gemme oplysningerne i "Rediger BilledeEtiketter" vinduet, som vil poppe op efter 'Acquire sekvens'.
- Læs baseline scanning af hvert dyr før indsprøjtningen af OI farvestof eller bruge naive kontroldyr at differentiere baggrundssignal.
- h efter haleveneinjektion af OI farvestof, placere dyrene i centrum af FOV, i stand til at måle det højeste signal i OI systemet, og start målingerne.
BEMÆRK: Vigtigt: Hypotermi kan i væsentlig grad påvirke fordelingen af billeddannende midler. Sørg for, at scenen opvarmes til 37 ° C for at undgå hypotermi af dyret. Billeddannelse kan udføres samtidigt med dyr i grupper på 1 til 5 mus. Vælg størrelsen af FOV afhængig af antallet af dyr for at måle på samme tid. Du kan tage et lyst felt billede at kontrollere, om hver mus er synlig.
5. Data Analysis
BEMÆRK: Udfør dataanalyse ved hjælp af billedet software efterproducentens protokol.
- Til måling af RA, bruge den kalibrerede enhed af photonemission som vist i figur 2, hvorimod kronisk CHSR er afbilledet som signalintensiteten i procent (effektivitet).
- At tegne ROI'er manuelt, bruge værktøjet plade. Til analysen af RA billeder bruger en standardiseret cirkel, placeret rundt om højeste signal i alle ankler og poter fra hvert dyr. For at analysere CHSR, placere ROI'er rundt om hele højre og venstre øre i henhold til den lyse billedfeltet.
- At måle fotonemission eller signal intensitetsværdier i den specifikke trukket ROI trykke "foranstaltning". Systemet vil give værdier i trukket ROI for beskrivende statistisk analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at inducere rheumatoid arthritis (RA) hos naive BALB / c-mus, blev dyr injiceret ip med auto-antistoffer (1: 1 fortynding med 1x PBS) mod GPI på dag 0. Den maksimale betændelse (ankel hævelse) i denne GPI-serum induceret RA model er på dag 6 efter injektionen 11. Derfor, 2 nmol den aktiverbare OI farvestof blev fremstillet og injiceret iv i halevenen på mus med arthritis og raske kontroldyr på dag 5. 24 timer efter injektion (dag 6) blev musene bedøvet, og afbildes som beskrevet i i afsnit 3 ( figur 1A).
For at inducere CHR, blev C57BL / 6-mus sensibiliseret med 5% TNCB på dag 0 ved barberede abdomen. På dag 7 efter sensibilisering den 1. udfordring på højre øre ved hjælp 1% TNCB startede. Op til fem udfordringer (dag 15) blev udført for at inducere kronisk inflammation. 7 12 timer efter the sidste udfordring, 20 nmol af OI farvestof blev injiceret iv. På dag 15, 24 timer efter injektion, blev OI udført som beskrevet ovenfor (figur 1B).
Figur 2 viser en klart forbedret fluorescens signal i bagpoterne, ankler og forpoter i RA-mus på dag 6 efter sygdomsinduktion, sammenlignet med kontrol ankler (figur 2A). Biodistribution analyse af MMP-aktivitet i organer af RA mus og sunde mus udviste en stærkt forbedret signal i bagpoterne, ankler og forpoter udelukkende i leddene i RA-mus. Interessant bestemte vi en forbedret MMP signal i begge nyrer af alle målte RA-mus, sammenlignet med nyrerne fra raske kontrolmus (Fig 2A, højre). Desuden har vi målt en forbedret MMP signal i leveren og tarmen uanset om mus lider RA. Ingen forskelle mellem RA og raske mus blev fundet i tHan bugspytkirtel, lunge, milt og hjerte.
Under kronisk CHR (fem TNCB udfordringer ved højre øre), måler vi stærkt øget MMP aktivitet på højre inflammet øre sammenlignet med det sunde venstre kontrol øre ( Figur 2B ).
Således viser vores data en vigtig rolle for MMP-aktivitet under sygdomsprogression i begge inflammatoriske sygdomsmodeller.
Værktøj til bioluminescens og fluorescens tillader kvantificering af for eksempel pmol fluorchrom eller antallet af celler, der udtrykker fluorescens. Data kan vises i 1. Tæller: Viser en ukalibreret måling af fotonidentiteten på kameraet. 2. Radiance (fotoner): Indikerer en kalibreret måling af fotonemissionen i "fotoner / sekund / cm 2 / steradian", hvilket er Anbefales til luminescens billeddannelse eller 3. Radiant Efficiency (fluorescens): viser fluorescensemission udstråling pr indfaldende excitation magt, anbefales til fluorescensmålinger.
En stor fordel ved at arbejde med udstråling enheder, mens analysere OI billeder er, at kameraindstillinger kan ændres i løbet af et eksperiment, og det har ingen indflydelse på de billeder, selv eller de målte data ROI, hvilket yderligere giver sammenligne billeder fra forskellige IVIS systemer.
Regionen af interesse (ROI) angiver det specifikke område af interesse fra brugeren i et optisk billede. Værktøjslinjen gør det muligt at trække 3 forskellige ROIs: måling (foranstaltninger signalintensiteten i ROI af billedet), gennemsnitlig baggrund (foranstaltninger gennemsnitssignalet intensitet i brugerens afgrænsede område til baggrunden) eller emne ROI (identificerer et individ dyr i et billede).
Hvis motivet disspiller en høj uspecifik baggrund signalere selv, opnå en måling ROI baggrund korrigeret ved at subtrahere baggrunden signal (ROI) fra målet ROI. Indstil minimum billedet tæt på nul for at bestemme den automatiske fluorescens eller naturligt forekommende baggrund luminescens i dit billede. Linke billedet til en selv-defineret (brugerspecifikke) baggrundsbillede (ROI), der blev målt primært den målte specifikke billede.
Semi-kvantitative analyser af billederne blev udført ved at tegne standardiserede områder af interesse (ROI) i både gigt og styre ankler, samt i betændte og sunde ører ved hjælp af Living Billede softwaren. Kun beskrivende statistiske analyser blev udført på in vivo data i dette håndskrift, på grund af utilstrækkelig antal dyr. Analyse af signalintensiteten af arthritiske og sunde ankler eller ben viste en 7 fold forbedret MMP-signalintensiteten i arthritisk, sammenlignet med kontrol ankler. En 3-gange højere MMP signalintensiteten blev påvist i forpoterne af arthritiske mus sammenlignet med den for de raske dyr (figur 3A).
Analyse af ører med akut og kronisk CHR sammenlignet med den venstre ubestridte kontrol øre viste en signifikant øget MMP signal, selv efter 1. udfordring, som yderligere forøget efter 3. og forblev på samme niveau, indtil det 5. challenge (figur 3B) . Som følge af kontaminering med kontaktallergenet på venstre øre på grund af ridser af musene, bestemte vi en let øget MMP signal i venstre (ikke TNCB udfordret) kontrol øre. Resultaterne indikerer en vigtig rolle af MMP'er, bekræftet af en stærkt forøget fluorescens signal under GPI-arthritis og kronisk inflammation, målt ved OI.
Load / 55180 / 55180fig1.jpg "/>
Figur 1: RA og CHR Model, Time Course of Disease Induktion og Time Points for OI. (A) Tidsforløb af RA induktion i BALB / c mus (B) og kronisk CHR induktion i C57BL / 6 mus. Oversigt over respektive in vivo billeddannelsestidspunkt og associerede injektionstidspunkter for OI-farvestoffet til måling af MMP-aktivitet i begge modeller. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: MMP OI i RA, CHR og Control Animals. (A) Repræsentative resultater af den målte MMP-aktivitet i en arthritisk mus 6 dage efter GPI-arthritisinduktion og en sund kontrolmus (venstre side). Signifikant højere signal (Radiance (p / s / cm 2 / sr)) intEnsitet blev observeret i arthritik sammenlignet med den sunde mus. Billedet til højre viser MMP-aktiviteten i bagpoten og omfatter ankler, forpoter, bugspytkirtlen, lungen, milt, hjerte, nyrer, lever og tarme af en aflivet GPI-arthritismus efter OI-farvestofinjektion. OI afdækkede et højt signal i de forpoter, ankler og bagpoter af RA mus og lever og tarm, uanset om musene blev injiceret med GPI serum (RA mus) eller kontrol serum (sunde kontrolmus). (B) MMP fluorescenssignal i ører med kronisk CHR (venstre) og kontroldyr (højre). Det betændte højre øre (udfordret 5 gange) viser et stærkt forbedret signal sammenlignet med kontrolører. Klik her for at se en større version af denne figur.
<Figur 3: Halvkvantitativ analyse af inflammerede og sunde ankler og ørevæv ved anvendelse af OI. (A) Halvkvantitativ analyse af fluorescenssignalet i RA og raske dyr i de forreste poter og ankelled. Artritiske frontpoter og ankelledder viser et signifikant (** p <0,05) (n = 3) højere MMP signal sammenlignet med sunde ankelled og forpote. Dataene præsenteres som middelværdien ± SD. (B) Halvkvantitativ analyse af venstre og højre (udfordrede) ører efter 1. , 3. og 5. udfordring. MMP-signalet øges signifikant fra den første til den femte udfordring og viste allerede en maksimal signalintensitet i det rigtige udfordrede øre efter 3. udfordring (** p <0,05) (n = 3) (Kontrolører er delvis forurenet med TNCB På grund af musens ridser. Dette gav et forbedret signal, som ikke var signifikant). Dataene er præsenteret som middelværdien± SEM. Den 2-halede t-test blev anvendt til at analysere forskelle mellem inflammation (GPI-arthritiske ankler, højre behandlede ører) og kontrol (kontrol ankler, venstre ubehandlede ører) for begge modeller. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OI er et meget nyttigt, hurtigt og billigt værktøj til ikke-invasiv in vivo molekylær billeddannelse i præklinisk forskning. En særlig styrke af OI er evnen til at overvåge meget dynamiske processer som inflammatoriske reaktioner. Desuden giver OI mulighed for at følge sygdomsforløbet i længere tid, alt fra dage til uger.
OI har flere fordele i forhold til andre in vivo billeddannelsesmodaliteter som positronemissionstomografi (PET) eller magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), da det er meget tids- og omkostningseffektivt. Høj-gennemstrømningsanalyse med op til fem dyr pr. Erhvervelse er mulig. Desuden er der et stort antal prober, der er målrettet mod mange forskellige biologiske processer. 12 For at tilvejebringe yderligere anatomiske oplysninger kan OI kombineres med andre billeddannelsesteknikker såsom MR eller røntgen. En anden begrænsning er dens lave vævspenetrationsdybde sammenlignet fx til fUnktionel PET-billeddannelse. Desuden er der en stor mængde prober, der sigter mod mange forskellige biologiske mål. 12
Effekter af anæstesi bør ikke undervurderes i in vivo billeddannelse. Mens specifikke virkninger af anæstesi på OI-resultater ikke er karakteriseret godt, har vores gruppe i flere undersøgelser vist indflydelse af anæstesi på PET-billeddannelsesresultater. 13 , 14 , 15 Fuchs et al. Analyserede blodparametre, såsom pCO2, pH og lactat før og efter PET-scanninger ved hjælp af forskellige vejrtræknings- og anæsteseprotokoller. Det blev påvist, at signifikante ændringer i pCO2- og lactatniveauer bedøvet sammenlignet med bevidste ilt- eller luftpustende mus medførte signifikante ændringer i PET-resultater. 14 De konkluderer, at denne effekt primært er forårsaget af iltpustning og efterfølgendeT til respiratorisk acidose hos dyr, hvilket fører til de forskellige resultater i PET-billeddannelsen.
Standardisering af anæstesiparametre, som O 2 -koncentrationer og doser af anæstetika, samt forebyggelse af hypotermi hjælper med at undgå systematiske fejl. Selvfølgelig er OI begrænset af fysiske egenskaber, f.eks. Lysspredning, vævsautofluorescens og lysdæmpning 9 . Flere grupper behandler disse problemer ved at kombinere de makroskopiske resultater af OI med andre teknikker som fluorescensmikroskopi in vivo eller flowcytometri.
In vivo billeddannelse af MMP aktivitet ved MMP-specifikke aktiverbare fluorescerende prober er blevet anvendt i flere eksperimentelle modeller af inflammation som CHS, 7 men også i sygdomme som cerebral iskæmi, 16 aorta aneurysmer, 17 myokardieinfarkt 18Og aterosklerotiske plaques 19 såvel som forskellige tumormodeller. 20
For eksempel beskriver Cortez-Retamozo et al. Undersøgte in vivo- aktiviteten af MMP'er i en model af allergisk luftvejsinflammation ved injektion af en MMP-aktiverbar probe 24 timer efter intranasal påføring af ovalbumin hos tidligere sensibiliserede mus. 21 For at identificere placeringen af MMP-aktivitet, kombinerede denne gruppe yderligere tomografisk OI, NIR fiberoptisk bronkoskopi og intravital mikroskopi for at overvåge sygdomsforløbet og behandlingsresponsen mere detaljeret. 21
Andre fremgangsmåder til måling af in vivo MMP-aktivitet bruger hovedsageligt inhibitorer af MMP, som binder til det aktive sted for MMP'er. McIntyre et al. Beskrevet en in vivo tumorassocieret MMP-7 detektion under anvendelse af et "polymerbaseret fluorogent substrat", som virker som et "proteolytIc beacon "for MMP'er i en mus xenograft model 22 De viser, at aktiviteten af MMP-7 kunne detekteres selektivt ved optisk billeddannelse. 23 Endvidere undersøgte Olson et al. Undersøgte" aktiverbare cellepenetrerende peptider "(ACPP'er), som er i stand til at Målrette mod mange xenograft tumor modeller, men kan ikke adsorbere ind i cellen, indtil linkeren er proteolyseret. De undersøgte ACPP'er, der er selektive for MMP-2 og MMP-9.
Mærkning af MMP-inhibitorer med radioaktive isotoper til enkeltfotonemissions-computertomografi (SPECT) eller PET-billeddannelse blev brugt til at studere MMP-ekspression i aterosklerose 26 og kræft 27 . I en nylig undersøgelse blev en fluorescens-mærket MMP-inhibitor sammenlignet med en MMP-aktiverbar probe. 28 Den fluorescensmærkede MMP-inhibitor viste et lavere signal til støjForhold i forhold til en aktiverbar probe, men krævede en kortere optagetid.
Nye biomarkører til at vurdere nøglefunktioner i patofysiologi kan udnyttes og valideres af OI. F.eks. Er responsen på fareassocierede molekylære mønstre (DAMP'er) en tidlig begivenhed under en inflammatorisk reaktion. Vogl et al. Brugte et Cy5.5-mærket antistof mod alarmin S100A9 i modeller af akut ørehuddermatitis, kollageninduceret arthritis og infektion med Leishmania major for at udvikle følsom biomarkør for tidlige tegn på inflammation. 29
Sammenfattende repræsenterer OI en hurtig og effektiv metode til præklinisk forskning, der er i stand til at afdække nye sygdomsmekanismer in vivo , karakteriserende nye molekylære mål samt overvågning af terapeutiske virkninger . Ikke desto mindre kan en efterfølgende valideringsproces med mere kvantitative teknikker som PET være påkrævet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Daniel Bukala, Natalie Altmeyer og Funda Cay for fremragende teknisk support. Vi takker Jonathan Cotton, Greg Bowden og Paul Soubiran for at redigere manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Werner Siemens-fonden og det medicinske fakultet for Eberhard Karls Universitet Tübingen ('' Promotionskolleg '') og af DFG gennem CRC 156 (projekt C3).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cornergel | Gerhard Mann GmbH | 1224635 | ophthalmic ointment |
| Forene | Abbott GmbH | 4831850 | isoflurane |
| U40 insulin syringe | Becton Dickinson and Company | 324876 | |
| Heparin | Sintetica | 6093089 | |
| High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm | Reichelt Chemietechnik GmbH+Co | 28460 | polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61 mm |
| BD Regular Bevel Needles, 30 G | Becton Dickinson & Co. Ltd. | 305106 | 30 G injection cannula |
| RTA-0011 isoflurane vaporizer | Vetland Medical Sales and Services LLC | - | |
| Artagain drawing paper | Strathmore Artist Paper | 446-8 | coal black |
| IVIS Spectrum | Perkin Elmer | 124262 | Optical imaging system |
| BD Regular Bevel Needles, 25 G | Becton Dickinson and Company | 305122 | |
| 2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene | Sigma Aldrich GmbH | 7987456F | TNCB |
| MMPSense 680 | Perkin Elmer | NEV10126 | fluorescent imaging dye |
| Oditest | Koreplin GmbH | C1X018 | mechanical measurment |
| Miglyol 812 | SASOL | - | Oil |
| BALB/C, C57BL/6 | Charles River Laboratories | - | Mice used for experiements |
| PBS | Sigma Aldrich GmbH | For dilution of the RA serum | |
| Pipette (100 µL) | Eppendorf | Used for TNCB application | |
| shaver | Wahl | 9962 | Animal hair trimmer |
| Living Image | Perkin Elmer | Imaging software to measure OI |
References
- Veale, D. J., Ritchlin, C., FitzGerald, O. Immunopathology of psoriasis and psoriatic arthritis. Ann Rheum Dis. 64, 26 (2005).
- Harris, E. D. Rheumatoid arthritis. Pathophysiology and implications for therapy. N Engl J Med. 322 (18), 1277-1289 (1990).
- Lee, D. M., Weinblatt, M. E. Rheumatoid arthritis. Lancet. 358 (9285), 903-911 (2001).
- Firestein, G. S. Immunologic mechanisms in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. J Clin Rheumatol. 11, S39-S44 (2005).
- Pap, T., et al. Differential expression pattern of membrane-type matrix metalloproteinases in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum. 43 (6), 1226-1232 (2000).
- Firestein, G. S., Paine, M. M. Stromelysin and tissue inhibitor of metalloproteinases gene expression in rheumatoid arthritis synovium. Am J Pathol. 140 (6), 1309-1314 (1992).
- Schwenck, J., et al. In vivo optical imaging of matrix metalloproteinase activity detects acute and chronic contact hypersensitivity reactions and enables monitoring of the antiinflammatory effects of N-acetylcysteine. Mol Imaging. 13, (2014).
- Monach, P. A., Mathis, D., Benoist, C.
- Zelmer, A., Ward, T. H. Noninvasive fluorescence imaging of small animals. J Microsc. 252 (1), 8-15 (2013).
- Kouskoff, V., et al. Organ-specific disease provoked by systemic autoimmunity. Cell. 87 (5), 811-822 (1996).
- Fuchs, K., et al. In vivo imaging of cell proliferation enables the detection of the extent of experimental rheumatoid arthritis by 3'-deoxy-3'-18f-fluorothymidine and small-animal PET. J Nucl Med. 54 (1), 151-158 (2013).
- Schwenck, J., et al. Fluorescence and Cerenkov luminescence imaging. Applications in small animal research. Nuklearmedizin. 55 (2), 63-70 (2016).
- Mahling, M., et al. A Comparative pO2 Probe and [18F]-Fluoro-Azomycinarabino-Furanoside ([18F]FAZA) PET Study Reveals Anesthesia-Induced Impairment of Oxygenation and Perfusion in Tumor and Muscle. PLoS One. 10 (4), 0124665 (2015).
- Fuchs, K., et al. Oxygen breathing affects 3'-deoxy-3'-18F-fluorothymidine uptake in mouse models of arthritis and cancer. J Nucl Med. 53 (5), 823-830 (2012).
- Fuchs, K., et al. Impact of anesthetics on 3'-[18F]fluoro-3'-deoxythymidine ([18F]FLT) uptake in animal models of cancer and inflammation. Mol Imaging. 12 (5), 277-287 (2013).
- Liu, N., Shang, J., Tian, F., Nishi, H., Abe, K. In vivo optical imaging for evaluating the efficacy of edaravone after transient cerebral ischemia in mice. Brain Res. 1397, 66-75 (2011).
- Sheth, R. A., Maricevich, M., Mahmood, U. In vivo optical molecular imaging of matrix metalloproteinase activity in abdominal aortic aneurysms correlates with treatment effects on growth rate. Atherosclerosis. 212 (1), 181-187 (2010).
- Chen, J., et al. Near-infrared fluorescent imaging of matrix metalloproteinase activity after myocardial infarction. Circulation. 111 (14), 1800-1805 (2005).
- Wallis de Vries, B. M., et al. Images in cardiovascular medicine. Multispectral near-infrared fluorescence molecular imaging of matrix metalloproteinases in a human carotid plaque using a matrix-degrading metalloproteinase-sensitive activatable fluorescent probe. Circulation. 119 (20), e534-e536 (2009).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Cortez-Retamozo, V., et al. Real-time assessment of inflammation and treatment response in a mouse model of allergic airway inflammation. J Clin Invest. 118 (12), 4058-4066 (2008).
- McIntyre, J. O., et al. Development of a novel fluorogenic proteolytic beacon for in vivo detection and imaging of tumour-associated matrix metalloproteinase-7 activity. Biochem J. 377, 617-628 (2004).
- Scherer, R. L., VanSaun, M. N., McIntyre, J. O., Matrisian, L. M. Optical imaging of matrix metalloproteinase-7 activity in vivo using a proteolytic nanobeacon). Mol Imaging. 7 (3), 118-131 (2008).
- Olson, E. S., et al. In vivo characterization of activatable cell penetrating peptides for targeting protease activity in cancer. Integr Biol (Camb. 1 (5-6), 382-393 (2009).
- Duijnhoven, S. M., Robillard, M. S., Nicolay, K., Grull, H. Tumor targeting of MMP-2/9 activatable cell-penetrating imaging probes is caused by tumor-independent activation). J Nucl Med. 52 (2), 279-286 (2011).
- Schafers, M., Schober, O., Hermann, S. Matrix-metalloproteinases as imaging targets for inflammatory activity in atherosclerotic plaques. J Nucl Med. 51 (5), 663-666 (2010).
- Wagner, S., et al. A new 18F-labelled derivative of the MMP inhibitor CGS 27023A for PET: radiosynthesis and initial small-animal PET studies. Appl Radiat Isot. 67 (4), 606-610 (2009).
- Waschkau, B., Faust, A., Schafers, M., Bremer, C. Performance of a new fluorescence-labeled MMP inhibitor to image tumor MMP activity in vivo in comparison to an MMP-activatable probe. Contrast Media Mol Imaging. 8 (1), 1-11 (2013).
- Vogl, T., et al. Alarmin S100A8/S100A9 as a biomarker for molecular imaging of local inflammatory activity. Nat Commun. 5, 4593 (2014).
