Isolatie van endotheliale cellen van gezonde vrijwilligers en hun trekkende Potential Beïnvloed door Serum monsters na Hartchirurgie

Summary

Endotheliale voorlopercellen (EPC's) zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. Deze werkwijze beschrijft de isolatie van humane EPC uit perifeer bloed, maar ook de identificatie van het trekkende bieden tegen sera van patiënten die hartchirurgie ondergaan.

Abstract

Endotheliale voorlopercellen (EPC's) worden gerekruteerd uit het beenmerg onder pathologische omstandigheden, zoals hypoxie en zijn cruciaal betrokken zijn bij de vorming van nieuwe bloedvaten van ischemische weefsels. De oorsprong, classificatie en karakterisering van EPC's zijn complex; Desondanks hebben twee prominente subtypes van EPC's vastgesteld: de zogenaamde "early" EPC's (later aangeduid als vroeg-EPC's) en late-uitgroei EPC's (late-EPC's). Ze kunnen worden ingedeeld biologische eigenschappen en hun verschijning in in vitro kweek. Terwijl "vroege" EPC's verschijnen in minder dan een week na het kweken van perifere bloed afgeleide mononucleaire cellen in EC-specifieke media, kan late-uitgroei EPC's worden na 2-3 weken. Late-uitgroei EPC's zijn erkend als rechtstreeks betrokken zijn bij neovascularisatie, voornamelijk door hun vermogen om te differentiëren in mature endotheelcellen, terwijl "vroege" EPC's te uiten verschillende angiogene factoren als endogenelende lading angiogenese te bevorderen in een paracriene manier. Tijdens myocardiale ischemie / reperfusie (I / R), verschillende factoren beheersen de homing van EPC regio's van bloedvatvorming.

Macrofaag migratie-remmende factor (MIF) is een chemokine-achtige pro-inflammatoire en alomtegenwoordig uitgedrukt cytokine en werd onlangs beschreven als de belangrijkste regulator van de EPC's migratie functioneren bij fysiologische concentraties ^1. Interessant MIF opgeslagen in intracellulaire pools en kan snel worden vrijgegeven in de bloedstroom na enkele stimuli (bijvoorbeeld myocardinfarct).
Dit protocol beschrijft een werkwijze voor de betrouwbare isolatie en kweek van vroege EPC van volwassen menselijk perifeer bloed gebaseerd op CD34-positieve selectie met daaropvolgende kweek in medium dat endotheliale groeifactoren op met fibronectine beklede platen voor toepassing bij in vitro migratie assays tegen serummonsters van cardiale chirurgische patiënten. Bovendien is detrekkende invloed van MIF op chemotaxis van EBV in vergelijking met andere bekende angiogenese-stimulerende cytokinen wordt aangetoond.

Introduction

Endotheliale progenitor cellen (EPC) circuleren in het menselijk bloed en hebben het vermogen om te differentiëren in endotheliale cellen ^2. Zij deelnemen aan vasculogenese en kunnen minimaliseren van de schade veroorzaakt door ontsteking en ischemie / reperfusie (I / R) letsel op verschillende wijzen ^{3, 4.} Bijvoorbeeld EBV tonen verhoogde intracellulaire antioxidant enzymen zoals catalase, glutathion peroxidase of mangaan superoxide dismutase (MnSOD) ^5. De verhoogde weerstand tegen oxidatieve stress laat EPC functioneren in micro-omgevingen met verhoogde reactive oxygen species (ROS) na ischemisch letsel ^6. Eerdere studies gaven ook aan dat het aantal EBV kan worden gecorreleerd aan vasculaire hersteld en dat een verminderd aantal circulerende EPC voorspelt het optreden van cardiovasculaire gebeurtenissen ^7,class = "xref"> 8. Echter, een duidelijke definitie van een EPC is nog niet gevonden. Tot nu toe is er geen specifieke celoppervlak merker of consistente fenotype voor EBV en deze cellen zijn zeer zeldzaam in het perifere bloed ^9. Een menselijke EPC moet worden beschouwd als een circulerende cel met het vermogen bij te dragen tot de reconstructie van de gewonden endotheel en nieuwe vasculaire structuren.

Een manier om het isoleren en karakteriseren van EPC's is door middel van hechting aan fibronectine. Daardoor wordt de capaciteit van deze cellen gebruikt om een superieure hechting zien aan beklede schalen in vergelijking met type 1 collageen, bijvoorbeeld ^{3, 10, 11} fibronectine. Maar anderen vonden dat plating mononucleaire cellen op met fibronectine beklede schalen zonder enige verdere zuivering of stap leidt tot kolonies waaronder myeloïde progenitorcellen, monocyten en T-lymfocyten ^{12, 13, 14.} Bovendien is in dit geval bloedplaatjes kan verontreinigen mononucleaire cellen (MNC) fractie en daardoor plasmamembraaneiwitten aan enige hechtende cellen ^15.

Naast karakterisatie door middel van in vitro hechting assays, is een combinatie van verschillende celoppervlak markers gebruikt om een celtype beschouwd als EPC beschrijven. In dit geval, na fibronectine-gemedieerde adhesie worden de cellen geanalyseerd met betrekking tot hun endotheel-achtige kenmerken. Hierbij twee endotheliale cel-geassocieerde markers, geacetyleerd-low density lipoproteïne (AcLDL) en vasculaire endotheliale groeifactor receptor 2 (VEGFR-2, KDR), een rol spelen. Endotheelcellen en macrofagen is aangetoond dat specifiek nemen AcLDL een proces genaamd "scavenger cel pathway" ^16. Andere merkereiwit KDR als belangrijkste VEGF receptor op endotheliale¹⁷ cellen. Zoals EPC in het algemeen gekweekt in media waaraan endotheliale groeifactoren en foetaal kalfserum, is het mogelijk dat macrofagen, wat kan ook zijn ongeluk geïsoleerd, vertonen een endotheel-achtige merkerprofiel. Zoals eerder getoond, indien gekweekt in een endotheliaal geconditioneerd medium, macrofagen express "endotheel-specifieke" ¹⁸ eiwitten.

In het algemeen zijn er twee categorieën van EBV in meer subtypen, die kan worden gevonden in het bloed of in vitro worden gekweekt. Late-uitgroei EPC's (late-EPC's) verschijnen na 2-3 weken van de cultuur. Deze cellen sneller geïntegreerd in een monolaag van humane navelstrengader endotheelcellen en kunnen capillaire buizen ¹⁹ vormen. Daarnaast zogenaamde "early-EBV" circuleren in het bloed gedurende een week en handelen passieve doorgang leveren angiogene moleculen, zoals vasculaire endotheelgroeifactorfactor (VEGF), of CXCL8 ^19. Patiënten met coronaire hartziekte (CAD) vertoonden significant lagere hoeveelheden vroegtijdige EBV vergeleken met een controlegroep zonder CAD ^20. Interessant dezelfde groep vertoonden hogere hoeveelheden late-EBV vergeleken met een controlegroep. Een andere studie toonde aan dat vroege EPC's te beschermen gedifferentieerde EPC's van apoptose onder oxidatieve omstandigheden in een paracriene wijze ^6. Daarom zou vroege EPC relevante beschermende effecten door de migratie van andere cellen in een auto- of paracriene manier binnen het perifere bloed te voorzien.

Dit protocol beschrijft een werkwijze voor vroegtijdige EPC zuiveren door eerst het isoleren van de PBMC-fractie uit menselijk perifeer bloed en vervolgens het isoleren van CD34 ⁺ cellen uit de PBMC-fractie deze celsuspensie tegen ongewenste cellen te verwijderen. CD34 is een marker, die wordt gebruikt voor de isolatie van humane hematopoietische stamcellen ⁹ </sup>. Daarna CD34 ⁺ cellen gekweekt op met fibronectine gecoate weefselkweek oppervlakken. Na drie dagen wordt het medium vervangen, waarbij alle niet-hechtende cellen te verliezen. Tenslotte worden geïsoleerd EBV gekleurd om de opname van AcLDL en de aanwezigheid van KDR als endotheelcel-merker door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) te controleren. Als extra marker, analyseerden we bloedplaatjes endotheel adhesiemolecuul (PECAM-1, CD31), die ook voorkomt op endotheliale cellen.

Herstel van beschadigde of geïnfarceerde hartspierweefsel door verbeterde werving van EPC's behoort tot de intensief onderzocht behandelingsstrategieën in hart- en vaatziekten. De vertaling van experimentele resultaten in de klinische praktijk is nog uitdagend, gezien de complexe cellulaire interactie in het menselijk lichaam in verschillende pathofysiologische omstandigheden. Verder myocardiale I / R letsel veroorzaken een overmatige afscheiding van verschillende cytokinen, hormonen en groei fac tors, die de homing van EPC's controleren om gebieden van bloedvatvorming ^13. Zoals reeds aangetoond, CXCL8, stromale cel-afgeleide factor 1α (SDF-1α, CXCL12), VEGF en macrofaag migratie-remmende factor (MIF) zijn aanzienlijk toegenomen in serummonsters na myocard I / R schade ^1. Tot deze factoren behoren, MIF is een pleiotrope chemokine-achtige cytokine met overwegend pro-inflammatoire eigenschappen. In tegenstelling tot de historische naam MIF heeft pro-migrerende functioneert, als een echte chemokine bij verschillende celtypen ^{1, 21, 22.} MIF-gemedieerde wervingsprocessen zijn gekoppeld aan de chemokine-receptoren CXCR4 en CXCR2, die MIF bindt aan en activeert een niet-verwante wijze ^21. Van de nota, EPC's uitdrukken beide van deze receptoren op hun oppervlak, die bovendien up-gereguleerd worden onder hypoxische conditiesass = "xref"> ^{23, 24.} Bovendien accumuleren aanwijzingen dat MIF een totale cardio-beschermend effect tijdens I / R schade van het hart ^{22, 25, 26.} In deze context, is verder gebleken dat MIF de vorming van nieuwe bloedvaten tijdens hypoxische stress die is van bijzonder belang, wanneer gezien de beperkte herstel mechanismen van de benadeelde myocard ²⁷ kan ondersteunen. Vorige in vitro studies en experimenten in pre-klinische muismodellen verstrekt eerste bewijs over de rol van MIF in EPC recruitment ^4. Van de nota, MIF is ook een prominent cargo eiwit van EPC's die tijdens de EPC werving binnen ischemische plaatsen ²⁸ kan worden vrijgegeven. Studies in klinische settings name in vergelijking met andere (angiogene) serum cytokines blijft ongrijpbaar.

Protocol

Bloed voor de isolatie van EBV werd verkregen van gezonde vrijwilligers na geïnformeerde toestemming overeenkomstig de lokale ethische commissie. Serummonsters gebruikt in migratie assays werden verkregen van patiënten die conventionele hartchirurgie ondergingen met behulp van cardiopulmonaire bypass (CPB). Uitsluitingscriteria waren noodoperaties, bekende of vermoedelijke zwangerschap, patient`s leeftijd jonger dan 18 jaar, en het niet geïnformeerde toestemming te verkrijgen. Serummonsters werden getrokken naast kli…

Representative Results

Karakterisering van geïsoleerde endotheliale voorlopercellen Ten eerste, de opname van AcLDL werd gecontroleerd, evenals de expressie van KDR en CD31 op het oppervlak van de geïsoleerde celpopulatie. Zoals figuur 7a toont, 85,1% van de geïsoleerde EPC's toonde een opname van AcLDL en uitgedrukt CD31. Figuren 7b en 7c tonen verder een homogene verdeling van beide markers, a…

Discussion

Het eerste deel van deze studie omvatte de isolatie van humane EPC's uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers om een ​​grondige evaluatie van het bloed van cardiochirurgische patiënten mogelijk te maken. Daarom werd een dichtheidsgradiënt centrifugatie uitgevoerd om de PBMC fractie uit plasma, granulocyten en erytrocyten te scheiden. De meeste verontreinigende bloedplaatjes te verwijderen, was dit celfractie onderworpen aan korte en langzame wasstappen ^29, <sup class=…

Materials

Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells