从健康志愿者和它们的迁徙可能通过血清中的影响心脏手术后的内皮祖细胞的分离

Summary

内皮祖细胞（EPCs）的关键参与缺血组织的新血管形成。这个方法描述了从外周血内皮祖细胞的分离，以及它们对心脏手术患者的血清样品洄游潜在的识别。

Abstract

内皮祖细胞（EPCs）从像缺氧的病理条件下骨髓招募并关键参与缺血组织的新血管形成。内皮祖细胞的起源，分类和特征是复杂的;尽管如此，两个突出的子类型内皮祖细胞已经建立：所谓“早”内皮祖细胞（后来被称为早期的EPC）和晚期产物内皮祖细胞（后期的EPC）。它们可以通过生物学性质以及通过体外培养过程中其外观进行分类。而“早”内皮祖细胞在EC-特定媒体外周血单个核细胞培养后出现在不到一周的时间，后期生长内皮祖细胞可以2-3周后才会发现。后期长出的EPCs已经识别到直接参与新血管形成，主要是通过其分化成成熟内皮细胞的能力，而“早”内皮祖细胞表达各种血管生成因子如子叶OU的货物以促进血管生成的旁分泌方式。在心肌缺血/再灌注（I / R），各种因素控制的EPC到血管形成区域归位。

巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）是一种趋化因子样促炎和遍在表达的细胞因子和最近描述的在生理浓度¹起作用内皮祖细胞迁移的关键调节剂。有趣的是，MIF存储在细胞内池，并且可以迅速地被释放到经过刺激血液流（ 如心肌梗塞）。
本协议描述了从成人外周血基于与随后的培养在培养基中的使用纤连蛋白涂层板内皮生长因子对血清样本的体外迁移实验CD34阳性选择早期内皮祖细胞的可靠分离培养方法的心脏手术的患者。此外，该MIF对内皮祖细胞的趋化性迁徙的影响力相比其他知名血管生成的细胞因子刺激论证。

Introduction

内皮祖细胞（EPCs）的循环中的人血和具有分化成血管内皮细胞²的能力。他们参与血管生成，并能够最小化以各种方式^3,4引起的炎症和缺血/再灌注（I / R）损伤的损害。例如，内皮祖细胞内展示抗氧化酶过氧化氢酶一样，谷胱甘肽过氧化物酶，锰超氧化物歧化酶（歧化酶^）5水平升高。对氧化应激的升高电阻允许内皮祖细胞在缺血性损伤后⁶升高的活性氧（ROS）的微环境的作用。以前的研究还表明，内皮祖细胞的数目可能是相关的血管修复和循环内皮祖细胞的数目减少预测心血管事件⁷的发生^，类=“外部参照”> 8。然而，EPC一个明确的定义还没有找到呢。到现在为止，对于内皮祖细胞没有特定的细胞表面标记物或一致的表型和这些细胞在外周血⁹非常罕见的。一个人类的EPC应视为以促进受伤内皮和新血管结构的重建能力的循环细胞。

分离和表征内皮祖细胞的一种方式是通过粘附于纤连蛋白。从而，这些细胞的能力被用来显示优异的粘合性纤连蛋白相比1型胶原蛋白，例如^3，10，11涂覆菜肴。然而，其他人发现，镀上纤连蛋白包被的培养皿的单核细胞，没有任何先前的或进一步的纯化步骤导致菌落包括骨髓祖细胞，单核细胞和T淋巴细胞^{12，13，14。}此外，在这种情况下，血小板可能污染的单核细胞（MNC）部分和由此质膜蛋白转移到任何贴壁细胞^15。

除了通过在体外粘附试验表征，不同的细胞表面标志物的组合被用于描述视为一个EPC细胞类型。在这种情况下，纤连蛋白介导的粘附之后，将细胞进行分析关于其内皮样的属性。在此过程中，两个内皮细胞相关标记物，乙酰化低密度脂蛋白（acLDL）和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2，KDR），发挥作用。内皮细胞和巨噬细胞已显示出特别占用acLDL在一个被称为“清道夫细胞途径^”16的过程。另一个标志物蛋白是KDR作为对内皮主VEGF受体细胞^17。然而，如在一般的EPCs在补充有内皮细胞生长因子和胎牛血清的培养基中培养，有可能是巨噬细胞，这可能也已被错误地分离，表现出内皮状标志物谱。如前所示，如果内皮空调的培养基培养，巨噬细胞表达“特定内皮”的蛋白质^18。

在一般情况下，有两类更亚型内内皮祖细胞，其可在血液中找到或在体外进行培养。后期产物内皮祖细胞（后期的EPC）2-3周的文化之后。这些细胞被集成快进人脐静脉内皮细胞单层，并能形成毛细管^19。此外，所谓的“早期内皮祖细胞”在血液中循环以更无源的方式约一周并充当通过递送血管生成分子，如血管内皮生长因子（VEGF），或CXCL8 ^19。患者冠状动脉疾病（CAD）显示显著较低的数额早期内皮祖细胞相比，没有CAD ²⁰对照组。有趣的是，相比于对照组相同的组显示出较高量的后期内皮祖细胞。另有研究表明，早期内皮祖细胞分化保护内皮祖细胞凋亡的氧化条件下，在旁分泌方式^6。因此，早期内皮祖细胞可能提供通过其他细胞的一个自动或旁分泌的方式外周血内迁移相关的保护作用。

这个协议描述了通过首先分离人外周血的PBMC级分并随后从PBMC级分中分离^的 CD34 ⁺细胞以清除不需要的细胞此细胞悬浮液以纯化早期内皮祖细胞的方法。 CD34是一个标记，其用于人类造血干细胞⁹的隔离</sup>。事后，CD34 ⁺细胞是在纤连蛋白包被的组织培养表面进行培养。三天后，将培养基更换，从而失去所有非贴壁细胞。最后，分离的内皮祖细胞进行染色，以验证acLDL的摄取和KDR存在内皮细胞标记物，通过使用荧光激活细胞分选（FACS）。作为额外的标记，我们分析血小板内皮细胞粘附分子（PECAM-1，CD31），其也发生在内皮细胞上。

通过内皮祖细胞的招募增强受损或梗死心肌组织的恢复属于心血管疾病的深入研究治疗策略。然而，实验结果到临床实践的翻译仍然具有挑战性的，因为在各种病理生理条件在人体内的复杂的细胞相互作用。此外，心肌I / R损伤触发各种细胞因子，激素和生长FAC的过度分泌器，它控制内皮祖细胞的归巢到的血管形成^13个区域。如已经示出，CXCL8，基质细胞衍生因子1α（SDF-1α，CXCL12），血管内皮生长因子和巨噬细胞迁移抑制因子（MIF）的显著血清样品中的心肌I / R损伤¹增加。在这些因素中，MIF是主要具有促炎性特性的多效性趋化因子样细胞因子。相反，它的历史名称，MIF具有促迁移功能，作为对各种细胞类型^1，21，22真正的趋化因子。 MIF介导的细胞募集过程已经链接到趋化因子受体CXCR2和CXCR4，其中MIF结合并以非同源方式²¹激活。值得注意的是，内皮祖细胞同时表达这些受体在它们的表面，在其上附加地成为上调低氧条件下的屁股=“外部参照”> ^23，24。此外，越来越多的证据表明，MIF中的心脏^22，25，26的I / R损伤期间具有总体心脏保护作用。在这种情况下，它已被进一步表明MIF可能缺氧的压力是特别重要的，考虑到受伤的心肌²⁷的有限恢复机制，当在支持新生血管。在临床前小鼠模型先前的体外研究和实验提供了有关MIF在内皮祖细胞募集⁴的作用第一个证据。值得注意的是，MIF也是内皮祖细胞的一个显着货物的蛋白质可能内皮祖细胞招募中的缺血部位²⁸内发布。然而，与其他（血管）血清细胞因子比较特别的临床研究的设置仍然无法实现。

Protocol

按照当地伦理委员会知情同意后，从健康的志愿者得到血内皮祖细胞的分离。在迁移实验中使用的血清样本来自行常规心脏手术使用体外循环（CPB）的患者。排除标准是紧急行动，已知或怀疑怀孕，patient`s年龄小于18岁，而未能获得知情同意书。血清样品中除了临床常规测量（立即手术之前和之后立即主动脉阻断的心肌再灌注/开口），随后保存于-80℃直至最终分析绘制。该机构审查委员会（伦理?…

Representative Results

隔离内皮祖细胞的表征首先，acLDL的摄取验证，以及KDR的分离的细胞群的表面上的表达，和CD31。如图7a所示，分离的内皮祖细胞的85.1％，表现出acLDL的摄取和表达CD31。 图7b和7c进一步证明两种标记的均匀分布，虽然似乎有一个较小的种群，负两个标记。在第二步骤中，进行与KDR组合acLDL的FACS?…

Discussion

这项研究的第一部分包括从健康志愿者外周血内皮祖细胞的分离，使心脏手术患者的血液进行综合评价。因此，进行密度梯度离心以分离血浆，粒细胞和红细胞PBMC部分。以除去大部分污染的血小板，该细胞级分进行短和慢洗涤步骤^29，30。接着，CD34 ⁺细胞是从剩余的成分中分离到的祖细胞从剩余淋巴细胞，和单核细胞中分离出来。最后，将细胞?…

Materials

Fibronectin	Biochrom AG	L7117	Coating of T-75 flasks
Aqua ad iniectabilia	Fresenius Kabi
Endothelial cell growth medium MV2	Promo Cell	C-22221
Endothelial cell growth medium MV2 SupplementMix	Promo Cell	C-39226
Ficoll-Paque plus	GE Healthcare	17-1440-03	Density centrifugation
EasySep human CD34 positive Selection Kit	Stemcell Technologies	18056	Isolation of CD34+ cells
EasySep magnet	Stemcell Technologies	18000
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Detachment of cells
Corning HTS transwell 96 well permeable supports	Sigma-Aldrich	CLS3387-8EA	Migration system
Hoechst solution	ThermoFisher	33342	Staining of migrated cells
ImageJ	National institutes of health	xxx	Counting of migrated cells