وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية
Summary
هنا، فإننا نقدم pluripotent البشرية بروتوكولات الثقافة الخلايا الجذعية (هبسك)، يستخدم للتفريق بين هبسكس إلى CD34+ فروعه المكونة للدم. يستخدم هذا الأسلوب الخاصة بمرحلة التلاعب الكنسي WNT الإشارات لتحديد الخلايا حصرا لأي برنامج نهائي أو البدائية المكونة للدم.
Abstract
أحد الأهداف الرئيسية للطب التجديدي هو الجيل والحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs) المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس). حتى وقت قريب، الجهود الرامية إلى التمييز بين هبسكس إلى هسكس الغالب ولدت فروعه المكونة للدم التي تفتقر إلى إمكانات HSC، وبدلاً من ذلك تشبه كيس ألمح هيماتوبويسيس. قد تكون محدودة فروعه المكونة للدم الناتجة عن هذه الأداة المساعدة لفي المختبر النمذجة المرض من مختلف الاضطرابات المكونة للدم الكبار، لا سيما تلك المتعلقة الأنساب اللمفاوية. بيد أننا مؤخرا وصف أساليب توليد اريثرو-ميلو-اللمفاوية فروعه المكونة للدم نهائي مولتيلينيجي من هبسكس استخدام بروتوكول تمايز موجهة الخاصة بالمرحلة، التي تبين لنا هنا. من خلال الانفصال الانزيمية من هبسكس على الغشاء بلاستيكواري المغلفة بالمصفوفة، تتشكل الهيئات امبريويد (EBs). ميزت الحديدية إلى ميسوديرم من BMP4 المؤتلف، التي تم تحديدها في وقت لاحق إلى نهائي البرنامج المكونة للدم مثبط GSK3β، CHIR99021. بدلاً من ذلك، يتم تحديد هيماتوبويسيس البدائية من مثبط بوركن، IWP2. هيماتوبويسيس إضافية مدفوعة عن طريق إضافة المؤتلف VEGF وداعمة السيتوكينات المكونة للدم. موروث المكونة للدم الناتجة التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الأسلوب لديها القدرة على استخدامها للمرض والنمذجة التنموية، و في المختبر.
Introduction
الخلايا الجذعية البشرية pluripotent (هبسكس) وتعرف بأنها تشمل كلا من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس) والخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس)، ولديها القدرة على فريدة من نوعها ليس فقط تمر الذاتي تجديد تحت ظروف النمو المناسبة، ولكن أيضا، القدرة على التفريق في جميع أنواع الخلايا المستمدة من الطبقات الجرثومية الثلاث: الأنسجة، mesoderm، والأديم الظاهر1. بسبب هذه قدرات فريدة من نوعها، هبسكس تبشر كبيرة للطب التجديدي، والنمذجة المرض، والعلاج يستند إلى الخلية2. بينما تم بنجاح التمييز بين أنواع متعددة من الخلايا من هبسكس، هو أحد التحديات الهامة في المختبر المواصفات حصرا الكبار مثل المستمدة من هبسك المكونة للدم الخلايا الجذعية (HSCs) وفروعه المكونة للدم نهائي.
أحد الحواجز المحتملة لتنمية البشرية هسكس من هبسكس هو وجود العديد من البرامج المكونة للدم في الجنين البشري3. البرنامج الأول الذي يخرج، يطلق عليه “هيماتوبويسيس البدائية،” ينشأ داخل الأنسجة اكسترامبريونيك صفار الكيس وأفضل تتميز بإنتاجها عابر اريثروبلاست موروث (أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية)، والضامة وميجاكاريوسيتيس. جدير بالذكر أن هذا البرنامج لا تثير هسكس ولا يعطي الارتفاع إلى فروعه اللمفاوية تي وب. ومع ذلك، كيس ألمح عابر تؤدي إلى فروعه المكونة للدم نهائية مقيدة، مثل السلف اريثرو النقوي (EMP4،5،6،،من78) وتفتقر إلى محمر اللمفاوية معبي multipotent السلف (لمب9). ومع ذلك، EMPs لا لمبس multipotent تماما، أو قادرة على انجرافتمينت مثل HSC في المستفيدين الكبار. على النقيض من ذلك، لاحقاً في التنمية، ويتم تحديد البرنامج المكونة للدم “نهائي” محددة بطريقة كلاسيكية في منطقة الشريان الاورطي-الغدد التناسلية-ميسونيفروس الجنين السليم، مما أدى إلى جميع الأنساب المكونة للدم الكبار، بما في ذلك HSC. مواصفات هذه الخلايا المكونة للدم نهائي داخل الجنينية يحدث بطريقة تعتمد على درجة، عبر مرحلة انتقالية غشائي–إلى–المكونة للدم من هيموجينيك البطانة (أنه)3،10،11 ،،من1213،14. وبصرف النظر عن القدرة على إعادة تشكيل، يمكن استخدام مولتيلينيجي المحتملة، ودرجة الاعتماد على هذه الخلايا لتمييز هذه فروعه المكونة للدم نهائياً من النبض الكهرومغناطيسي ولمب (إعادة النظر في الإشارات3،13 ).
فهم الآليات الناظمة البدائية ونهائي مواصفات المكونة للدم من هبسكس المرجح الحرجة لإنتاج استنساخه من فروعه المكونة للدم نهائي عبر مجموعة متنوعة من خطوط هبسك. حتى وقت قريب، هبسك التمايز البروتوكولات التي يمكن أن تفصل multipotent فروعه المكونة للدم البدائية ونهائي لا يوجد17،15،،من1618، 19،20،21،،من2223،،من2425. العديد من نهج استخدام مصل الدم البقري الجنين (FBS) و/أو الثقافة المشتركة stromal أولاً أوجز إمكانات المكونة للدم هبسك التمايز، مع خليط من البدائية والنهائية المكونة للدم المحتملين15،16، 17،،من1922،،من2325. علاوة على ذلك، وقد وصف العديد من البروتوكولات المكونة للدم خالية من المصل متطلبات إشارة لمواصفات mesoderm من هبسكس التي تؤوي المكونة للدم المحتملة18،،من2021، 24-ومع ذلك، كما لا تزال هذه الأساليب قد أثارت مخاليط غير متجانسة من كلا البرنامجين، قد يكون استخدامها في التطبيقات السريرية، وفهم آليات إنمائية محدودة.
أننا بنينا مؤخرا في هذه الدراسات، وقد حددت احتياجات الإشارات الخاصة بمرحلة أضافت/نضال وإشارات WNT في مواصفات المكونة للدم البدائية ونهائي من mesoderm المستمدة من هبسك18،26 . هذا الأخير كان خاصة فريدة من نوعها، كما استخدامها لمعالجة الإشارات WNT الخاصة بالمرحلة يسمح لمواصفات أما حصرا بدائية أو حصرا فروعه المكونة للدم نهائي26. خلال مواصفات mesoderm، يؤدي إلى تثبيط الإشارات WNT المتعارف عليه مع مثبط بوركن IWP2 مواصفات CD43+ أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية وفروعه النقوي، مع احتمال اللمفاوية لا يمكن كشفها. في تناقض حاد، أدى حفز الكنسي WNT الإشارات مع مثبط GSK3β، CHIR99021، خلال المرحلة ذاتها من التمايز الغياب الكامل للاكتشاف CD43+ أريب-مركبات الكربون الكلورية فلورية، بينما تؤدي في الوقت نفسه إلى مواصفات CD34+CD43− أنه. تمتلك هذه الفئة من السكان النقوي، HBG-الإعراب عن محمر، وإمكانات T اللمفاوية. التحاليل اللاحقة حددت هذا كان أنها تفتقر إلى التعبير عن CD7327،28 و CD18428، وإمكاناتها المكونة للدم تعتمد على درجة28. أظهرت التحليلات الاستنساخ علاوة على ذلك، خلية واحدة أن هذه السلالات المكونة للدم نهائي يمكن أن تستمد من خلايا مفردة multipotent28. أخذت معا، تشير هذه الدراسات إلى أن تحديد WNT مرحلة محددة مما يشير إلى التلاعب نقية فروعه المكونة للدم البدائية، أو تعتمد على درجة multipotent نهائي فروعه المكونة للدم.
هنا، فإننا مخطط استراتيجيتنا التمايز غلة فروعه المكونة للدم حصرا بدائية أو نهائية، عن طريق التلاعب بالمتعارف عليه WNT الإشارات خلال الزخرفة ميسوديرمال، وهذه النسب المكونة للدم المصب فحوصات. هذا البروتوكول قيمة كبيرة للمحققين الذين يرغبون في إنتاج بدائية أو نهائي أما فروعه المكونة للدم من هبسكس لتطبيقات الطب التجديدي.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول وصف أسلوب السريع، خالية من المصل، خالية من سدى للتفريق بين فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائية. يمكن تحقيق مواصفات ميسوديرمال من فروعه المكونة للدم أما بدائية أو نهائي موثوق استخدام لدينا البروتوكول، الذي يستغل فريد مثبطات جزيء صغير من إشارات WNT المتعارف عليه. الخاصة ب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كلية الطب جامعة واشنطن قسم الطب الباطني، “شعبة أمراض الدم”، دعمت هذا العمل. وأيد مؤتمر نزع السلاح T32HL007088 من الوطني للقلب والرئة، والدم المعهد. وأيد “المجتمع الأمريكي لأمراض الدم الباحث جائزة” CMS.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: lessons from embryonic development. Cell. 132 (4), 661-680 (2008).
- Ditadi, A., Sturgeon, C. M., Keller, G. A view of human haematopoietic development from the Petri dish. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (1), 56-67 (2017).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- McGrath, K. E., et al. A transient definitive erythroid lineage with unique regulation of the beta-globin locus in the mammalian embryo. Blood. 117 (17), 4600-4608 (2011).
- Palis, J., et al. Spatial and temporal emergence of high proliferative potential hematopoietic precursors during murine embryogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (8), 4528-4533 (2001).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Boiers, C., et al. Lymphomyeloid contribution of an immune-restricted progenitor emerging prior to definitive hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 13 (5), 535-548 (2013).
- Bertrand, J. Y., et al. Haematopoietic stem cells derive directly from aortic endothelium during development. Nature. 464 (7285), 108-111 (2010).
- Hadland, B. K., et al. A requirement for Notch1 distinguishes 2 phases of definitive hematopoiesis during development. Blood. 104 (10), 3097-3105 (2004).
- Kumano, K., et al. Notch1 but not Notch2 is essential for generating hematopoietic stem cells from endothelial cells. Immunity. 18 (5), 699-711 (2003).
- Medvinsky, A., Rybtsov, S., Taoudi, S. Embryonic origin of the adult hematopoietic system: advances and questions. Development. 138 (6), 1017-1031 (2011).
- Robert-Moreno, A., Espinosa, L., de la Pompa, J. L., Bigas, A. RBPjkappa-dependent Notch function regulates Gata2 and is essential for the formation of intra-embryonic hematopoietic cells. Development. 132 (5), 1117-1126 (2005).
- Chadwick, K., et al. Cytokines and BMP-4 promote hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells. Blood. 102 (3), 906-915 (2003).
- Davis, R. P., et al. Targeting a GFP reporter gene to the MIXL1 locus of human embryonic stem cells identifies human primitive streak-like cells and enables isolation of primitive hematopoietic precursors. Blood. 111 (4), 1876-1884 (2008).
- Kaufman, D. S., Hanson, E. T., Lewis, R. L., Auerbach, R., Thomson, J. A. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (19), 10716-10721 (2001).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (6), 1722-1735 (2012).
- Ledran, M. H., et al. Efficient hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells on stromal cells derived from hematopoietic niches. Cell Stem Cell. 3 (1), 85-98 (2008).
- Ng, E. S., et al. The primitive streak gene Mixl1 is required for efficient haematopoiesis and BMP4-induced ventral mesoderm patterning in differentiating ES cells. Development. 132 (5), 873-884 (2005).
- Pick, M., Azzola, L., Mossman, A., Stanley, E. G., Elefanty, A. G. Differentiation of human embryonic stem cells in serum-free medium reveals distinct roles for bone morphogenetic protein 4, vascular endothelial growth factor, stem cell factor, and fibroblast growth factor 2 in hematopoiesis. Stem Cells. 25 (9), 2206-2214 (2007).
- Vodyanik, M. A., Bork, J. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Human embryonic stem cell-derived CD34+ cells: efficient production in the coculture with OP9 stromal cells and analysis of lymphohematopoietic potential. Blood. 105 (2), 617-626 (2005).
- Vodyanik, M. A., Thomson, J. A., Slukvin, I. I. Leukosialin (CD43) defines hematopoietic progenitors in human embryonic stem cell differentiation cultures. Blood. 108 (6), 2095-2105 (2006).
- Yu, C., et al. Retinoic acid enhances the generation of hematopoietic progenitors from human embryonic stem cell-derived hemato-vascular precursors. Blood. 116 (23), 4786-4794 (2010).
- Zambidis, E. T., Peault, B., Park, T. S., Bunz, F., Civin, C. I. Hematopoietic differentiation of human embryonic stem cells progresses through sequential hematoendothelial, primitive, and definitive stages resembling human yolk sac development. Blood. 106 (3), 860-870 (2005).
- Sturgeon, C. M., Ditadi, A., Awong, G., Kennedy, M., Keller, G. Wnt Signaling Controls the Specification of Definitive and Primitive Hematopoiesis From Human Pluripotent Stem Cells. Nat Biotechnol. 32 (6), 554-561 (2014).
- Choi, K. D., et al. Identification of the hemogenic endothelial progenitor and its direct precursor in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Rep. 2 (3), 553-567 (2012).
- Ditadi, A., et al. Human Definitive Haemogenic Endothelium and Arterial Vascular Endothelium Represent Distinct Lineages. Nat Cell Biol. 17 (5), 580-591 (2015).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 23, (2001).
- La Motte-Mohs, R. N., Herer, E., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T-cell development from human cord blood hematopoietic stem cells by Delta-like 1 in vitro. Blood. 105 (4), 1431-1439 (2005).
- Schmitt, T. M., et al. Induction of T cell development and establishment of T cell competence from embryonic stem cells differentiated in vitro. Nat Immunol. 5 (4), 410-417 (2004).
- Holmes, R., Zuniga-Pflucker, J. C. The OP9-DL1 system: generation of T-lymphocytes from embryonic or hematopoietic stem cells in vitro. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (2), (2009).
- Polychronopoulos, P., et al. Structural basis for the synthesis of indirubins as potent and selective inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and cyclin-dependent kinases. J Med Chem. 47 (4), 935-946 (2004).
- Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of Wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol. 5 (2), 100-107 (2009).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. , (2017).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Peschle, C., et al. Embryonic—-Fetal Hb switch in humans: studies on erythroid bursts generated by embryonic progenitors from yolk sac and liver. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (8), 2416-2420 (1984).
