Dirigido a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivo e definitiva de células pluripotentes humanas
Summary
Aqui, apresentamos pluripotentes humanas de protocolos de cultura de células-tronco (hPSC), usados para diferenciar hPSCs em CD34+ progenitores hematopoiéticos. Este método usa a manipulação de estágio específico de WNT canônico sinalização para especificar células exclusivamente para ambos o programa hematopoiética definitivo ou primitivo.
Abstract
Um dos objetivos principais para a medicina regenerativa é a geração e manutenção de células-tronco hematopoiéticas (linfócitos) derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs). Até recentemente, os esforços para diferenciar hPSCs em linfócitos predominantemente geraram progenitores hematopoiéticos que faltam potencial HSC e em vez disso se assemelham a hematopoiese saco vitelino. Estes progenitores hematopoiéticos resultantes podem ter limitado utilitário para modelagem em vitro de doença de várias desordens hematopoiéticas adultos, particularmente aqueles das linhagens linfoides. No entanto, recentemente descrevemos métodos para gerar Eritro-Mielo-linfoide multilineage definitivos progenitores hematopoiéticos de hPSCs usando um protocolo de estágio específico dirigido diferenciação, que nós esboçamos aqui. Através de dissociação enzimática de hPSCs na membrana basal matriz-revestido plasticware, formam-se órgãos do embryoid (EBs). EBs são diferenciadas a mesoderme por recombinação BMP4, que posteriormente é especificado para o programa definitivo hematopoiético do inibidor de GSK3β, CHIR99021. Alternativamente, hematopoiese primitivo é especificado o inibidor PORCN, IWP2. Hematopoiese é impulsionado ainda mais através da adição de recombinação VEGF e citocinas hematopoiéticas solidária. Os progenitores hematopoiéticos resultantes gerados usando esse método tem o potencial para ser utilizado para a doença e a modelagem do desenvolvimento, em vitro.
Introduction
Células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) são definidas como englobando tanto células-tronco embrionárias humanas (hESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas humana (hiPSCs) e tem a capacidade única de não só passando por auto-renovação sob condições adequadas de crescimento, Mas também, a capacidade de se diferenciar em todos os tipos de células derivadas das três camadas germinativas: endoderme, mesoderme e ectoderme1. Devido a essas habilidades únicas, hPSCs segurar a grande promessa para a medicina regenerativa, modelagem de doença e de terapias baseadas na célula2. Enquanto vários tipos de células têm sido diferenciados com êxito de hPSCs, um desafio significativo é a especificação em vitro de exclusivamente como adulto hPSC-derivado tronco células hematopoiéticas (linfócitos) e progenitores hematopoiéticos definitivos.
Um provável barreira para o desenvolvimento de linfócitos humanos de hPSCs é a presença de múltiplos programas hematopoiéticas dentro do embrião humano3. O primeiro programa que emerge, denominado “hematopoiese primitivo,” origina-se dentro do tecido extraembryonic saco vitelino e melhor caracteriza-se por sua produção transiente de progenitores eritroblasto (EryP-CFC), macrófagos e megacariócitos. Notavelmente, este programa não dá origem a linfócitos, nem dá origem a progenitores linfoides T e B. No entanto, o saco vitelino transitoriamente originar restritos definitivas progenitores hematopoiéticos, tais como o progenitor mieloide-Eritro (EMP4,5,6,7,8) e o deficiente eritroide linfoide-aprontadas multipotent progenitor (LMPP9). No entanto, EMPs nem LMPPs são totalmente multipotentes, ou capaz de HSC-como enxertia em adultos destinatários. Em contraste, mais tarde, em desenvolvimento, o programa hematopoiético “definitivo” classicamente definido é especificado na região da aorta-gônada-mesonephros do embrião propriamente dito, dando origem a todas as linhagens hematopoéticas adultas, incluindo o HSC. A especificação dessas células hematopoiéticas definitivo intra embrionário ocorre em uma forma de entalhe-dependentes, através de uma transição endotelial-para-hematopoiéticas do hemogenic endotélio (ele)3,10,11 ,12,13,14. Além da capacidade de reconstituição, o potencial de multilineage e entalhe-dependência destas células podem ser usado para distinguir estes progenitores hematopoiéticos definitivos o EMP e o LMPP (revisto em referências3,13 ).
Compreender o mecanismo (s) que regem a especificação hematopoiética primitiva e definitiva de hPSCs é provável crítica à produção reprodutível de progenitores hematopoiéticos definitivas através de uma variedade de linhas hPSC. Até recentemente, hPSC protocolos de diferenciação que poderiam separar multipotentes progenitoras hematopoiéticas primitivas e definitivas não existia15,16,17,18, 19,20,21,22,23,24,25. Muitas abordagens usando soro fetal bovino (FBS) e/ou do estroma co-cultura primeiro delineou o potencial hematopoiético do hPSC diferenciação, com misturas de primitivo e definitivo hematopoiéticas potencial15,16, 17,19,22,23,25. Além disso, muitos protocolos isento de soro hematopoiéticos têm descrito os requisitos de sinal para a especificação da mesoderme de hPSCs que abriga hematopoiéticas potencial18,20,21, 24. no entanto, como esses métodos ainda deram origem a misturas heterogêneas de ambos os programas, seu uso em aplicações clínicas e mecanismos de compreensão do desenvolvimento pode ser limitado.
Temos recentemente construído sobre esses estudos, tendo descrito os requisitos específicos do estágio sinal para União/NODAL e sinalização de WNT na especificação hematopoiética primitiva e definitiva de hPSC-derivado do mesoderma18,26 . Este último foi particularmente original, como seu uso de manipulação de sinal WNT estágio específico permite a especificação de exclusivamente primitivo ou de progenitores hematopoiéticos definitivo exclusivamente26. Durante a especificação de mesoderme, a inibição da sinalização de WNT canônico com o inibidor PORCN IWP2 resulta na especificação de CD43+ EryP-CFC e progenitores mieloides, sem potencial linfoide detectável. Em contraste, estimulação de sinalização WNT canônico com o inibidor de GSK3β, CHIR99021, durante a mesma fase de diferenciação resultou na completa ausência de CD43 detectável+ EryP-CFC, enquanto simultaneamente levando para o especificação de CD34+CD43− . Esta população possuía mieloide, HBG-expressando eritroide e potencial T-linfoide. Análises subsequentes identificaram isso como falta a expressão de seu potencial hematopoiética e CD18428e CD7327,28 era entalhe-dependente28. Além disso, a única célula análises clonais demonstraram que estas linhagens hematopoiéticas definitivas podem ser derivadas de células únicas multipotentes28. Tomados em conjunto, estes estudos indicam que estágio específico WNT sinalização manipulação pode especificar progenitores hematopoiéticos primitivos puros, ou progenitores hematopoiéticos definitivos multipotentes de entalhe-dependente.
Aqui, nós esboçamos nossa estratégia de diferenciação que produz exclusivamente primitivos ou definitivas progenitores hematopoiéticos, através da manipulação de WNT canônico sinalização durante a padronização mesodérmicas e sua linhagem a jusante hematopoiética ensaios. Este protocolo é de grande valor para os investigadores que estão interessados na produção de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivos de hPSCs para aplicações de medicina regenerativa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método de rápida, livre de soro, estroma-livre para a diferenciação de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivos. Mesodérmicas especificação de progenitores hematopoiéticos primitivos ou definitivas pode ser confiantemente alcançada usando nosso protocolo, que explora com exclusividade a inibidores de pequenas moléculas de sinalização de WNT canônico. Activação do WNT estágio específico com o inibidor de GSK3β CHIR9902133 dá origem a meso…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelo departamento de medicina interna, divisão de Hematologia, Washington University School of Medicine. CD foi apoiada pelo T32HL007088 de nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue. CMS foi apoiado por uma sociedade americana de hematologia estudioso Award.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMD) | Corning | 10-016 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), ES cell rated | Gemini Bioproducts | 100-500 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Hyclone | SH30396.03 | |
| L-glutamine, 200 mM solution | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin-streptomycin | Life Technologies | 15070-063 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200056 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| Gelatin, porcine skin, Type A | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Alpha-MEM | Life Technologies | 12000-022 | |
| DMEM-F12 | Corning | 10-092-CV | |
| Knock-out serum replacement | Life Technologies | 10828028 | "KOSR" |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Life Technologies | 11140050 | |
| b-mercaptoethanol, 55 mM solution | Life Technologies | 21985023 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Fraction V, Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1605 | |
| Ham's F12 | Corning | 10-080 | |
| N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
| B27 supplement, no vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Stempro-34 (SP34) | Life Technologies | 10639011 | "SP34" |
| Growth factor reduced Matrigel | Corning | 354230 | "MAT" |
| L-absorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human serum transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Monothioglycerol (MTG) | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| Collagenase B | Roche | 11088831001 | |
| Collagenase II | Life Technologies | 17101015 | |
| DNaseI | Calbiochem | 260913 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Life Technologies | 14190144 | |
| bFGF | R&D Systems | 233-FB | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP | |
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE | |
| SCF | R&D Systems | 255-SC | |
| IGF-1 | R&D Systems | 291-G1 | |
| IL-3 | R&D Systems | 203-IL | |
| IL-6 | R&D Systems | 206-IL | |
| IL-7 | R&D Systems | 207-IL | |
| IL-11 | R&D Systems | 218-1L | |
| TPO | R&D Systems | 288-TP | |
| EPO | Peprotech | 100-64 | |
| Flt-3 ligand (FLT3-L) | R&D Systems | 308-FK | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| IWP2 | Tocris | 3533 | |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich | A9525 | |
| Losartan Potassium | Tocris | 3798 | |
| CD4 PerCP Cy5.5 Clone RPA-T4 | BD Biosciences | 560650 | Dilution 1:100; T cell assay |
| CD8 PE Clone RPA-T8 | BD Biosciences | 561950 | Dilution 1:10; T cell assay |
| CD34 APC Clone 8G12 | BD Biosciences | 340441 | Dilution 1:100; EHT assay |
| CD34 PE-Cy7 Clone 8G12 | BD Biosciences | 348801 | Dilution 1:100; Hemogenic endothelium |
| CD43 FITC Clone 1G10 | BD Biosciences | 555475 | Dilution 1:10; Hemogenic endothelium |
| CD45 APC-Cy7 Clone 2D1 | BD Biosciences | 557833 | Dilution 1:50; T cell assay |
| CD45 eFluor450 Clone 2D1 | BD Biosciences | 642284 | Dilution 1:50; EHT assay |
| CD56 APC Clone B159 | BD Biosciences | 555518 | Dilution 1:20; T cell assay |
| CD73 PE Clone AD2 | BD Biosciences | 550257 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| CD184 APC Clone 12G5 | BD Biosciences | 555976 | Dilution 1:50; Hemogenic endothelium |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | BD Biosciences | 564907 | Dilution 1:10,000; T cell assay |
| OP9 DL4 cells | Holmes, R. and J.C. Zuniga-Pflucker. Cold Spring Harb Protoc, 2009. 2009(2): p. pdb prot5156 | ||
| MethoCult H4034 | Stemcell Technologies | 4034 | "MeC" |
| Milli-Q water purification system | EMD Millipore | ||
| 5% CO2 incubator | Set at 37 C | ||
| Multigas incubator | Set at 37 C, 5% CO2, 5% O2 | ||
| 6 well tissue culture plate | Corning | 353046 | |
| 24 well tissue culture plate | Corning | 353226 | |
| 6 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3471 | |
| 24 well low-adherence tissue culture plate | Corning | 3473 | |
| 35 mm tissue culture dishes | Corning | 353001 | |
| Blunt-end needle, 16 gauge | Corning | 305198 | |
| 3 cc syringes | Corning | 309657 | |
| 5 mL polypropylene test tube | Corning | 352063 | |
| 5 mL polystyrene test tube | Corning | 352058 | |
| 15 mL polypropylene conical | Corning | 430791 | |
| 50 mL polypropylene conical | Corning | 430921 | |
| 2 mL serological pipette | Corning | 357507 | |
| 5 mL serological pipette | Corning | 4487 | |
| 10 mL serological pipette | Corning | 4488 | |
| 25 mL serological pipette | Corning | 4489 | |
| Cell scrapers | Corning | 353085 | |
| 2.0 mL cryovials | Corning | 430488 | |
| 5 mL test tube with 40 µM cell strainer | Corning | 352235 | |
| 40 µM cell strainer | Corning | 352340 | |
| Cell culture centrifuge | |||
| Biosafety hood | |||
| FACS AriaII or equivalent | |||
| LSRii or equivalent | |||
| FlowJo software | TreeStar | ||
| Water bath | Set at 37 C | ||
| 0.22 µM filtration system | Corning | ||
| Autoclave | |||
| 4 C refrigerator | |||
| -20 C Freezer | |||
| -80 C Freezer |
References
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