Biofysikalsk Karakterisering av flagellar motorikk

Summary

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Abstract

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Introduction

Flagellpol motorer gjør at cellene til å svømme ved å rotere spiral ekstracellulære filamenter. Mengden av dreiemomentet på motoren kan generere for en gitt lengde av flagellen (dvs. den viskøse belastning) bestemmer svømmehastigheter. På den annen side dets evne til å veksle rotasjonsretningen kontrollerer cellemigrering som reaksjon på kjemikalier, en prosess som kalles kjemotaksis. Chemotaxis og motilitet være virulens faktorer ^1-3, flagellpol motorer har blitt godt karakterisert gjennom årene ^4. Monterings bevis tyder nå på at motoren virker som en mechanosensor – det mekanisk detekterer tilstedeværelsen av faste substrater ^5,6. Denne evnen sannsynlig hjelper i å utløse overflaten kolonisering og infeksjoner ^5,7. Som et resultat av mekanismene hvorved motoren sanser overflater og initierer signalisering er av betydning ^8,9.

Den flagell Motoren kan lett undersøkes ved forankring av de flagellum på et substrat og å observere celle rotasjon. En slik deling ble først oppnådd ved Silverman og Simon, som jobbet med en polyhook mutant i E. coli og vellykket festet kroker til glass underlag med anti-krok antistoffer ^10. Den forankrede-celleanalyse aktivert forskere for å studere reaksjoner fra motorbryteren til en rekke kjemiske stimuli. For eksempel, Segall og medarbeidere kjemisk stimulert tethered celler ved hjelp av iontoforetiske pipetter. De tilsvarende endringer i CW _skjevhet (brøkdel av tiden motorer snurrer med klokken, CW) gjorde dem i stand til å måle kinetikken av tilpasning i kjemotaksien nettverket ^11,12. Mens tethered celle analysen var effektiv i å studere bryter svar, var det bare i stand til å tilby innsikt i bilmekanikere over et begrenset utvalg av tyktflytende masse ^13. For å løse dette problemet, Ryu og medarbeidere tjoret sfæriske, latex perler til filament stubber på celler stakk til overflater. Perlene varderetter spores ved hjelp av back-focal interferometri med svake optiske feller ^14. Ved å arbeide med perler av forskjellige størrelser, kan forskere studere motor over et mye bredere område av belastninger. Denne analysen ble senere forbedret ved Yuan og Berg, som utviklet en photomultiplier basert perle-sporing teknikk kombinert med laser mørke-feltet belysning. Deres metode aktivert sporing av tethered gull nanobeads som var så liten (~ 60 nm) at de eksterne viskøse motstander var lavere i forhold til de interne viskøse motstand til rotasjon ^15,16. Dette førte til at målinger av maksimalt oppnåelige hastigheter i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, tilsvar perle analyser aktivert målinger av spinning priser på innsats viskøse laster (~ 700 Hz) ^17. Ved å muliggjøre målinger av motorresponser over hele mulige området av viskøse laster (fra null belastning til nær-stall), bead-analysene gitt en viktig biofysisk verktøy for å forstå torque generasjon prosessen ^18,19.

Nylig endret vi Yuan-Berg analysen å inkludere optiske pinsetter som gjorde oss i stand til å anvende presise mekaniske stimuli til individuelle motorer ^6. Ved hjelp av denne teknikken, viste vi at kraftgeneratorer som roterer motoren er dynamiske mechanosensors – de fornye som reaksjon på endringer i viskøse laster. Det er mulig at en slik lastfølende utløser celledifferensiering i svermende bakterier, selv om mekanismene uklare. Det er også sannsynlig at flagellpol motorer i andre arter er også mechanosensitive ^20, selv om direkte bevis mangler. Her diskuterer vi photomultiplier-baserte (PMT) tilnærming for å spore rotasjon av latexkuler tjoret til flagellpol filamenter ^15. I forhold til sporing med lynraske kameraer, er det photomultiplier-setup en fordel fordi det er relativt enkelt å spore enkelt perler i sanntid og over lang durasjoner. Det er spesielt nyttig når man studerer lang tid ombygging i flagellpol motor komplekser på grunn av miljømessige stimuli ^21. Selv om vi detaljerte protokoller spesielt for E. coli, kan de lett tilpasses for å studere flagellære motorer i andre arter.

Protocol

1. Cell Forberedelse Grow natten kulturer av den ønskede stamme som bærer den klebrige Flic allel 15,22 i Trypton buljong (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl) etterfulgt av poding på 1: 100 fortynning i 10 ml frisk TB. Dyrk kulturen ved 33 ° C i en risteinkubator til OD600 = 0,5. Pellet cellene ved 1500 xg i 5 – 7 min og re-dispergere pellet kraftig i 10 ml filtersterilisert motilitet buffer (MB; 10 mM fosfatbuffer: 0,05 til 0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 mM metioni…

Representative Results

Fotomultiplikatoren oppsettet er vist i Figur 1A. Det er viktig at PMTs har høy følsomhet over området av bølgelengder spredt av kulene av interesse. De er ansatt her PMTs operere i de synlige og nær-infrarøde områder, og var i stand til å oppdage lyset spres av perler opplyst av en halogen lyskilde. De optimale lysforhold og spenninger vil variere fra ett oppsett til en annen. For oppsettet som brukes i dette arbeidet, en PMT gevinst ~ 10 a…

Discussion

For å lette tethered perle-sporing og korrekt estimering av motor-dreiemomenter, bør følgende informasjon gjennomgås. Når du utfører disse målingene med flagellerte celler, er klipping et kritisk punkt. Shearing reduserer flagell filamentet til en mer stump, for derved å sikre at den viskøse belastningen på motoren er hovedsakelig på grunn av vulsten og kan estimeres innenfor 10% feil ^16. Shearing forbedrer også sjansene for å finne sirkulære baner med tett fordelte eksentriske (<perle diamet…

Materials

Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 ml Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3×1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013