Analyse de la ségrégation chromosomique, de l'acétone d'histone et de la morphologie de la broche dans les ovocytes
Summary
Ce manuscrit décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement les ovocytes à cheval. Plus précisément, le présent travail illustre comment recueillir des ovocytes à cheval immatures et matures par captage d'ovules guidé par ultrasons (OPU) et comment étudier la ségrégation des chromosomes, la morphologie de la broche, l'acétylation des histones mondiales et l'expression de l'ARNm.
Abstract
Le domaine de la procréation assistée a été développé pour traiter la stérilité chez les femmes, les animaux de compagnie et les espèces en voie de disparition. Dans le cheval, la reproduction assistée permet également la production d'embryons de haut niveau sans interrompre leur carrière sportive et contribue à une augmentation du nombre de poulains chez les juments de haute valeur génétique. Le présent manuscrit décrit les procédures utilisées pour la collecte d'ovocytes immatures et matures à partir d'ovaires à cheval utilisant un prélèvement d'ovule (OPU). Ces ovocytes ont ensuite été utilisés pour étudier l'incidence de l'aneuploïdie en adaptant un protocole préalablement développé chez la souris. Plus précisément, les chromosomes et les centromères des ovocytes de la métaphase II (MII) ont été marqués par fluorescence et comptés sur des plans focaux séquentiels après un balayage par microscope laser confocal. Cette analyse a révélé une incidence plus élevée dans le taux d'aneuploïdie lorsque des ovocytes immatures ont été recueillis à partir des follicules et ont été mûris in vitro par rapport àIn vivo. L'immunocoloration pour la tubuline et la forme acétylée d'histone quatre à des résidus spécifiques de lysine a également révélé des différences dans la morphologie de la broche méiotique et dans le schéma global de l'acétylation des histones. Enfin, l'expression d'ARNm codant pour les histone désacétylases (HDAC) et les acétyl-transferases (HAT) a été étudiée par transcription inverse et PCR quantitative (q-PCR). Aucune différence dans l'expression relative des transcrits n'a été observée entre les ovocytes matures in vitro et in vivo . En accord avec un silence général de l'activité de transcription pendant la maturation des ovocytes, l'analyse de la quantité de transcription totale ne peut révéler la stabilité ou la dégradation de l'ARNm. Par conséquent, ces résultats indiquent que d'autres réglementations translationnelles et post-traductionnelles pourraient être affectées.
Dans l'ensemble, la présente étude décrit une approche expérimentale pour caractériser morphologiquement et biochimiquement l'ovocyte du cheval, un ceLl est extrêmement difficile à étudier en raison de la faible disponibilité des échantillons. Cependant, il peut élargir nos connaissances sur la biologie de la reproduction et la stérilité dans les espèces monovulatrices.
Introduction
Une vaste gamme de techniques de reproduction assistée a été développée pour traiter l'infertilité chez les femmes, les animaux de compagnie et les espèces en voie de disparition. L'une des procédures les plus courantes dans les milieux cliniques est la récupération des ovocytes de la métaphase II (MII) des follicules ovariens par aspiration transvaginale guidée par ultrasons, prélèvement d'ovule (OPU) 1 . Ces ovocytes sont ensuite fécondés in vitro (FIV), l'embryon (s) résultant (s) implanté (e) dans un utérus receveur. Les ovocytes de stade MII (matures) sont récupérés suite à l'administration de gonadotrophines exogènes. Cependant, ce traitement est associé, chez certains patients, au développement du syndrome d'hyperstimulation ovarienne (OHSS) 2 .
Prenant avantage de la capacité intrinsèque des ovocytes immatures (stade GV) pleinement développé à reprendre spontanément la méiose une fois isolée de leurs follicules, il est possible d'obtenir des ovocytes matures sans administrationLa gonadotrophine 3 . Cette procédure s'appelle la maturation in vitro des ovocytes (IVM) et représente une approche moins axée sur les médicaments, moins coûteuse et plus respectueuse du patient de la technologie de la reproduction assistée. Cependant, le succès du développement embryonnaire avec des ovocytes mûres in vitro est généralement inférieur à celui des ovocytes matures in vivo 4 , 5 . Une explication possible est que les ovocytes matures in vitro sont plus affectés par des erreurs dans la ségrégation chromosomique et l'aneuploïdie qui en résulte entrave le développement embryonnaire normal 6 .
La compréhension de la base moléculaire de la mauvaise séparation chromosomique pendant l'IVM révèlerait finalement le plein potentiel de cette technique. Dans cette optique, l'approche expérimentale utilisée pour étudier les caractéristiques morphologiques et biochimiques des ovocytes à matrice in vitro , par rapport à la matur in vivoLes ovocytes sont ici décrits 7 , 8 . Plus précisément, les procédures pour l'OPU des ovocytes immatures et mûres et l'IVM des ovocytes immatures sont illustrées à l'aide de chevaux adulte et naturellement cyclables en tant que modèle expérimental. Ensuite, l'immunofluorescence et l'analyse d'image sont utilisées pour étudier la ségrégation chromosomique, la morphologie de la broche et le modèle global d'acétylation des histones sur ces gamètes. Enfin, un protocole de transcription inverse et de PCR quantitative est décrit pour l'analyse de l'expression de l'ARNm.
Par rapport aux modèles animaux de rongeurs, les chevaux ne permettent pas la manipulation génétique, sont moins faciles à manipuler et nécessitent un entretien coûteux. Cependant, ce modèle prend un intérêt considérable pour l'étude de la maturation des ovocytes 9 , 10 en raison de la similarité avec la physiologie ovarienne humaine 11 , 12 </ Sup>. En outre, le développement de protocoles fiables de IVM-IVF dans le cheval a un intérêt économique substantiel, car il permettrait d'augmenter le nombre de poulains issus de juments de haute valeur génétique.
L'une des limites de l'exécution d'expériences sur les ovocytes, en particulier chez les espèces monovulatrices, est la disponibilité d'échantillon restreinte. Cette limite a été surmontée ici en ajustant une approche, précédemment développée chez la souris, aux ovocytes de chevaux 13 , 14 afin de mener le comptage des chromosomes qui minimise la perte d'échantillon (voir la discussion pour une comparaison avec d'autres techniques disponibles). En outre, un protocole de coloration à triple fluorescence a été optimisé pour effectuer des analyses multiples sur le même échantillon, et des analyses de q-PCR ont été réalisées uniquement sur des pools de 2 ovocytes.
Dans l'ensemble, la présente étude décrit une approche expérimentale visant à améliorer morphologiquement et biochimiquementRaccordez l'ovocyte du cheval, un type de cellule qui est extrêmement difficile à étudier en raison de la faible disponibilité de l'échantillon. Cependant, il peut étendre notre connaissance de la biologie de la reproduction et de la stérilité des espèces monovulatrices.
Protocol
Representative Results
Discussion
Même si la MIV a été réalisée chez les chevaux depuis plus de 20 ans 16 , nous ne savons pas encore si l'ovocyte peut être l'origine de l'aneuploïdie embryonnaire, comme cela a été proposé pour l'homme 17 . La raison en est probablement que la préparation de spreads d'ovocytes pour le comptage des chromosomes entraîne une perte d'échantillon considérable. Dans cet esprit, une enquête sur les méthodes utilisées pour enquêter sur les…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Fabrice Vincent pour le support avec la microscopie confocale à laser (LSCM) , et Philippe Barrière et Thierry Blard pour l'analyse quotidienne des ultrasons et l'injection de hCG. Ce travail a été soutenu en partie par le projet «Ex Ovo Omnia» de Regione Sardegna and Regione Lombardia (Subvention n ° 26096200 à AML); La bourse "L'Oreal Italie par le Donne et la Scienza 2012" (contrat 2012 à FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agence de recherche et de recherche (REA) "Pro-Ovum" (Subvention n ° 303640 à VL); Et par l'École postdoctorale d'agriculture et de médecine vétérinaire, cofinancée par le Fonds social européen, Programme opérationnel sectoriel pour le développement des ressources humaines 2007-2013 (numéro de contrat POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 à la messagerie instantanée). La collecte ovocyte in vivo a été financée par l'Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
References
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