馬の卵母細胞における染色体分離、ヒストンアセチル化およびスピンドル形態の解析
Summary
この原稿は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞を特徴付けるための実験的アプローチを記載している。具体的には、超音波誘導卵子ピックアップ（OPU）による未成熟および成熟ウマの卵母細胞の採取方法および染色体分離、紡錘体形態、全球ヒストンアセチル化およびmRNA発現を調べる方法を具体的に説明する。
Abstract
補助生殖の分野は、女性、コンパニオンアニマル、絶滅危惧種の不妊症を治療するために開発されました。馬では、補助生殖により、スポーツキャリアを中断することなく、高パフォーマーからの胚の生産が可能になり、高い遺伝子価値の牝馬からの仔馬の数の増加に寄与する。本稿は、卵巣ピックアップ（OPU）を用いて、馬の卵巣から未熟かつ成熟した卵母細胞を採取するために用いられる手順を記載している。次いで、これらの卵母細胞を使用して、以前にマウスで開発されたプロトコールを適合させることにより異数性の発生率を調べた。具体的には、共焦点レーザー顕微鏡走査後に、中期II（MII）卵母細胞の染色体およびセントロメアを蛍光標識し、逐次焦点計画でカウントした。この分析は、未成熟卵母細胞を卵胞から採取し、インビトロで成熟させた場合の異数性率が高いことを明らかにしたインビボで。特異的リジン残基でのチューブリンおよびアセチル化形態のヒストン4の免疫染色も、減数分裂紡錘体の形態およびヒストンアセチル化の全体的パターンにおける差異を明らかにした。最後に、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）およびアセチルトランスフェラーゼ（HAT）をコードするmRNAの発現を、逆転写および定量PCR（q-PCR）によって調べた。 インビトロおよびインビボで成熟した卵母細胞の間で転写物の相対的発現に差異は観察されなかった。卵母細胞成熟中の転写活性の一般的なサイレンシングと一致して、全転写量の分析は、mRNAの安定性または分解しか示さない。したがって、これらの知見は、他の翻訳および翻訳後の規制が影響を受ける可能性があることを示している。
全体として、本研究は、形態学的および生化学的に馬の卵母細胞サンプルの入手可能性が低いため、研究するのが非常に困難です。しかし、それは、生殖生物学および不妊症種についての私たちの知識を拡大することができます。
Introduction
女性、コンパニオンアニマル、絶滅の危機に瀕している種の不妊症を治療するための支援された生殖技術の広範な配列が開発されています。臨床設定における最も一般的な手順の1つは、超音波誘導経膣吸引、卵巣ピックアップ（OPU） 1による卵胞からの中期II（MII）ステージ卵母細胞の回収である。次いで、これらの卵母細胞をin vitro （IVF）で受精させ、得られた胚をレシピエント子宮に移植する。 MII期（成熟）卵母細胞は、外因性ゴナドトロピンの投与後に回収される。しかしながら、この治療は、一部の患者において、卵巣過剰刺激症候群（OHSS） 2の発症と関連している。
いったん卵胞から単離された減数分裂を自発的に再開する完全に増殖した未成熟卵母細胞（GVステージ）の本質的能力を利用して、投与することなく成熟卵母細胞を得ることが可能である性腺刺激ホルモンを摂取する3 。この手順は、卵母細胞のインビトロ成熟（IVM）と呼ばれ、繁殖技術を補助するために薬物志向性が低く、費用が低く、患者にやさしいアプローチです。しかし、 インビトロ で成熟した卵母細胞を用いた胚発生の成功は、一般にインビボで成熟した卵母細胞よりも低い4,5 。可能性のある説明は、インビトロで成熟した卵母細胞が染色体分離の誤りによってより影響を受け、その結果生じる異数性が正常な胚発生を損なうということである6 。
IVM中の染色体の誤分離の分子的基礎を理解することは、最終的にこの技術の完全な可能性を明らかにするであろう。この静脈では、 インビボで成熟した卵母細胞の形態学的および生化学的特徴をin vivoでの成熟と比較して調べるために実験的アプローチが用いられたここに記載されている7,8 。具体的には、未成熟卵母細胞および成熟卵母細胞のOPUおよび未成熟卵母細胞のIVMの手順を、実験モデルとして成体および自然循環馬を用いて説明する。次いで、免疫蛍光および画像分析を用いて、染色体分離、紡錘体形態およびこれらの配偶子上のヒストンアセチル化の全体的パターンを調べる。最後に、mRNA発現の分析のための逆転写および定量的PCRのプロトコルが記載される。
げっ歯類の動物モデルと比較して、馬は遺伝子操作を許さず、操作が容易でなく、高価なメンテナンスを必要とする。しかしながら、このモデルは、ヒト卵巣生理学との類似性のために、卵母細胞の成熟9,10の研究にかなりの関心を集めている11,12。/ sup>。さらに、馬におけるIVM-IVFの信頼できるプロトコールの開発は、高い遺伝的価値の牝馬からの仔馬の数の増加を可能にするので、実質的な経済的関心を有する。
卵母細胞、特に、単核種の実験を行うことの限界の1つは、制限されたサンプルの入手可能性である。この制限は、以前にマウスで開発された方法を、馬の卵母細胞13,14に調整して、サンプルの損失を最小限にする染色体計数を行うことによって克服されてきた（利用可能な他の技術との比較の説明を参照）。さらに、三重蛍光染色プロトコルを最適化して同じサンプルについて複数の分析を行い、q-PCR分析を2個の卵母細胞のプールのみで行った。
全体的に、本研究は、形態学的および生化学的なcha低いサンプルの入手可能性のために勉強することが非常に困難な細胞型であるウマ卵母細胞を狂わせる。しかし、それは生殖生物学および不稔性種の不妊症に関する知識を拡大することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
IVMは20年以上にわたって馬で行われてきたが、我々は卵母細胞が胚性異数性の起源であるかどうかはまだ分かっていない17 。その理由は、おそらく、染色体計数のための卵母細胞増殖の準備が、かなりの試料損失をもたらすことであろう。このことを念頭に置いて、染色体分離の誤りを調べるために用いた方法の調査を行って、馬の卵母細胞に適用する最も適切な技術を探?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者たちは、毎日超音波卵巣スキャンとhCG注射を行うために、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（LSCM） 、フィリップ・バリエールとティエリー・ブラードのサポートについてFabrice Vincentに感謝したい。この作品は、「Regione Sardegna and Regione Lombardia」プロジェクト「Ex Ovo Omnia」（無償で26096200からAMLへ）によって部分的に支持されました。 「L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012」フェローシップ（2012年からFFへの契約）、FP7-PEOPLE-2011- CIG、Research Executive Agency（REA）「Pro-Ovum」（付与番号303640からVL）欧州ソーシャルファンド、人的資源開発セクター別運営プログラム2007〜2013（契約番号POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371〜IM）と共同で資金を調達した農林水産省獣医学部によって実施された。 in vivoでの卵母細胞の回収は、Françaisdu Cheval et de l'Equitation研究所によって資金提供された。
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
References
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
