Мышиные лимфоцит Этикетировочное по⁶⁴ Си-антитело к рецептору Ориентация на<em> В Vivo</em> Cell Торговля ПЭТ / КТ

Summary

После получения ⁶⁴ Сu-модифицированного моноклонального антитела связывания с рецептором Т – клеток трансгенного мышея, Т – клетками являются радиоактивно метили в естественных условиях, анализировали на жизнеспособность, функциональность, стабильность маркировки и апоптоз, и адаптивно переносили в мышей с дыхательными путями гиперчувствительности замедленного типа реакцию для неинвазивного изображений с помощью позитронно-эмиссионной томографии / компьютерной томографии (ПЭТ / КТ).

Abstract

Этот протокол иллюстрирует получение ⁶⁴ Cu и хелатор конъюгацию / радиоактивную моноклональное антитела (монАТ) с последующим мышиной культурой лимфоцитов клеток и ⁶⁴ Cu-антитело рецептором ориентации клеток. В пробирке оценки мечена и неинвазивные в естественных условиях отслеживания клетки в животной модели с воздуховодной гиперчувствительности замедленного типа реакции (DTHR) с помощью ПЭТ / КТ описаны.

Более подробно, сопряжение с мАтом с хелатором 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислотой (DOTA) показано. После производства радиоактивного ⁶⁴ Cu, радиомечения в DOTA-конъюгированных мАт описано. Далее, расширение куриного овальбумина (Cova) -специфические CD4 ⁺ интерферона (ИФН) -γ-продуцирующих Т – хелперы (Кова-TH1) и последующее введение радиоактивной клеток COVA-ТН1 изображены. Различные методы в пробирке представлены для оценки эфффекты из ⁶⁴ Cu-радиомечения о клетках, таких как определение жизнеспособности клеток с помощью трипанового синих, окрашивания для апоптоза с аннексином V для проточной цитометрии, и оценка функциональности с помощью IFN-gamma иммуноферментного теста (ELISA) , Кроме того, определение радиоактивного поглощения в клетки и стабильность маркировки описаны в деталях. Этот протокол далее описывает, как выполнять исследование отслеживания клеток в животной модели для дыхательных путей DTHR и, следовательно, индукция COVA-индуцированных острого DHTR в дыхательных путях BALB / с мышеем включена. Наконец, надежная ПЭТ / КТ рабочего процесс, включая приобретение изображений, реконструкцию и анализ представлен.

⁶⁴ Cu-антитело , воздействующий подход рецептора с последующей интернализацией рецепторов обеспечивает высокую специфичность и стабильность, снижение клеточной токсичность, а также низкие цены эффлюксных по сравнению с обычными ПЭТ-индикаторами для маркировки клеток, например , ⁶⁴ Cu-pyruvaldehyde бис (N-4-methylthiosemicarbazone) ⁽⁶⁴ Cu-PTSM). И, наконец, наш подход позволяет неинвазивным в естественных условиях отслеживания клетки с помощью ПЭТ / КТ с оптимальным отношением сигнала к фону в течение 48 часов. Этот экспериментальный подход может быть переведен в различные моделях животных и типов клеток с мембраносвязанными рецепторами, которые усваиваются.

Introduction

Неинвазивная отслеживания клеток является универсальным инструментом для мониторинга функции клеток, миграции и самонаведения в естественных условиях. Недавние исследования отслеживания клетки были сосредоточены на мезенхимальных ^{1, 2} или костного мозга стволовых клеток , полученных ³ в контексте регенеративной медицины, аутологичных периферических белых кровяных клеток в воспалении или Т – лимфоцитов в приемными терапии клеток против рака ^{3, 4.} Выяснение мест действия и основных биологических принципов клеточной терапии имеет огромное значение. CD8 ⁺ цитотоксических Т – лимфоцитов, методами генной инженерии антиген химерный рецептор (CAR) Т – клетки или опухолевые-лимфоциты (Tīls) широко рассматривается как золотой стандарт. Тем не менее, ассоциированные с опухолью антиген-специфические Th1 клетки оказались эффективной альтернативой вариант лечения ^{4, <}/ SUP> ^{5, 6, 7.}

В качестве ключевых игроков в воспалении, орган-специфический аутоиммунных заболеваний (например, ревматоидный артрит или бронхиальная астма), и клеток , представляющих особого интереса в иммунотерапии рака, важно , чтобы охарактеризовать временные закономерности распределения и самонаводящиеся Th1 – клетки. Неинвазивные в естественных изображения с помощью ПЭТ представляет собой количественный, высокочувствительный метод ⁸ для изучения моделей миграции клеток, в естественных условиях ГСНЫ, и сайты действия Т – клеток и ответы во время воспаления, аллергии, инфекций или отторжения опухоли ^{9, 10, 11.}

Клинически, ¹¹¹ В-Oxine используется для лейкоцитарной сцинтиграфии для дискриминации воспаления и инфекции ^12, в то время как 2-дезокси-2- ⁽¹⁸F) , фтор-D-глюкозы ⁽¹⁸ F-ФДГ) обычно используется для отслеживания исследований клеток с помощью ПЭТ ^{3, 13.} Одним из главных недостатков этого ПЭТ трассирующими, однако, короткий период полураспада радионуклида ¹⁸ F в 109,7 мин и низкой внутриклеточной стабильности , которая препятствует визуализации в более поздние моменты времени после усыновителя перенос клеток. Для более длительного срока в естественном условиях исследования отслеживания клеток путем ПЭТ, хотя и нестабильные в клетках, ⁶⁴ Си-PTSM часто используются для обозначения неспецифический клетки ^{14, 15} с сведены к минимуму вредных воздействий на жизнеспособности Т – клеток и функции ^16.

Этот протокол описывает способ для дальнейшего уменьшения невыгодных воздействие на жизнеспособность и функции клеток с помощью Т-клеточного рецептора (TCR) -специфический радиоактивно меченый Mab. Во- первых, производство радиоизотопных ⁶⁴ Cu, конъюгации с монАТ KJ1-26 с гое хелаторы DOTA, и последующее ⁶⁴ Cu-радиоактивное показаны. На втором этапе, выделение и расширение COVA-TH1 клеток мышей – доноров DO11.10 и радиоактивной с ⁶⁴ Cu-нагруженной DOTA-конъюгированного монАТ KJ1-26 ⁽⁶⁴ Cu-DOTA-KJ1-26) описаны подробно. Оценка поглощения ценностей и оттоком радиоактивности с дозой калибратора и гамма-подсчета, соответственно, а также оценка эффектов ⁶⁴ Cu-радиомечения на жизнеспособность клеток с помощью трипанового синего и функциональности с IFN-gamma ELISA представлены , Для неинвазивной в естественных условиях отслеживания клетки, то извлечение из мышиной модели COVA-индуцированной острой DTHR дыхательных путей и изображений приобретения ПЭТ / КТ после приемных передачи клеток описаны.

Кроме того, этот подход маркировки может быть передан в различные модели заболеваний, мышиные Т-клетки с различным ТКРОМ или общими клетками, представляющего интереса с мембраносвязанными рецепторами или экспрессией MarKERS , лежащий в основе непрерывного мембраны челночного ^17.

Protocol

Меры предосторожности: При работе с радиоактивностью, хранить 64 Cu за 2 дюйма толщиной свинцовых кирпичей и использовать соответствующую защиту для всех судов , осуществляющих деятельность. Используйте соответствующие инструменты косвенно обращаться неэкранированных источнико…

Representative Results

На рисунке 1 приведены маркировки COVA-TH1 клеток с 64 Cu-DOTA-KJ1-26-монАТом и опытно – конструкторской для в пробирке и в естественных условиях исследования описанного в данном протоколе. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/55270/55…

Discussion

Этот протокол представляет собой надежный и простой способ стабильно радиометки клетки для отслеживания ин виво с помощью ПЭТ. Используя этот метод, COVA-TH1 клетки, выделенные и расширена в пробирке от мышей – доноров, могут быть помечены радиоактивным изотопом ⁶⁴ Cu-DOTA-KJ1-26-м…

Materials

HCl, Suprapur	Merck, Darmstadt, Germany	1.00318	64Cu production
Methanol, Suprapur	Merck, Darmstadt, Germany	1.06007	64Cu production
Isopropanol, Suprapur	Merck, Darmstadt, Germany	1.0104	64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate	Ögussa	Custom made	64Cu production
PEEK chamber	Ögussa	Custom made	64Cu production
64Ni	Chemotrade		64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate	Macherey-Nagel	805021	64Cu production
Ion exchange column	BioRad	AG1-X8	64Cu production
Solid state target system for PETtrace	WKL	costum made	64Cu production
64Cu work-up module	WKL	costum made	64Cu production
Dose calibrator	Capintec	CRC-25R
PETtrace cyclotron	General Electric Medical Systems
DOTA-NHS	Macrocyclics	B-280	DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26)		Isolated from hybridoma cell culture	DOTA-conjugation
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	71633	DOTA-conjugation
H+ Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit	Merck Millipore	UFC910008	DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water	Carl Roth	HN68.3	DOTA-conjugation
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	32301	DOTA-conjugation
PBS	University Tuebingen		DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column	Bio-Rad Laboratories	7326221	DOTA-conjugation
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	71497	DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager	Perkin-Elmer	L2250116	DOTA-conjugation
DMEM	Merck Millipore	102568	ingredient for T cell medium
FCS	Merck Millipore	S0115/1004B	ingredient for T cell medium
Sodium pyruvate	Merck Millipore	L0473	ingredient for T cell medium
MEM-amino acids	Merck Millipore	K0293	ingredient for T cell medium
HEPES	Merck Millipore	L 1613	ingredient for T cell medium
Penicillin/Streptomycin	Merck Millipore	A2212	ingredient for T cell medium
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	ingredient for T cell medium
DO11.10 mice		in-house breeding	TH1 cell culture
DPBS	Gibco	14190144	TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm	Corning	352340	TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer	Lonza	10-548E	TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse	Miltenyi Biotech	130-097-145	TH1 cell culture
QuadroMACS separator	Miltenyi Biotech	130-090-976	TH1 cell culture
LS column	Miltenyi Biotech	130-042-401	TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
Rabbit complement MA	tebu-Bio	CL3221	TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11)		Isolated from hybridoma cell culture	TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide	EMC-micro-collections	Custom order	TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides	Eurofins MWG Operon	Custom order	TH1 cell culture
IL-2	Novartis	65483-116-07	TH1 cell culture
96-well plates	Greiner	655180	TH1 cell culture
24-well plates	Greiner	662160	TH1 cell culture
cell culture flask	Greiner	660175	TH1 cell culture
48-well plates	Greiner	677 180	cell labeling
Gammacell 1000	Best Theratronics	via inquiry
Gulmay RT225	Gulmay	via inquiry
Trypan blue	Merck Millipore	L6323	in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA	BD Biosciences	558258	in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit	BD Biosciences	559763	in vitro evaluation
Tube 5 ml	Sarstedt	55.476	in vitro evaluation
Round-bottom tubes	BD Biosciences	352008	in vitro evaluation
Wizard γ-counter	Perkin-Elmer	2480-0010	in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX	Thermo Fisher Scientific	51118177	in vitro evaluation
Microscope	Leica	via inquiry	in vitro evaluation
BD LSRII	BD Biosciences	via inquiry	in vitro evaluation
BALB/c mice	Charles River	028	in vivo cell trafficking
Aluminum gel	Serva Electrophoresis	12261.01	in vivo cell trafficking
Xylazine	Bayer HealthCare	Ordered via University hospital	in vivo cell trafficking
Ketamine	Ratiopharm	Ordered via University hospital	in vivo cell trafficking
Isoflurane	CP-Pharma	Ordered via University hospital	in vivo cell trafficking
30G needle	BD Biosciences	304000	in vivo cell trafficking
Syringe	BD Biosciences	11612491	in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl	VWR	612-2439
Inveon PET scanner	Siemens Healthineers	no longer available	in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso
Inveon SPECT/CT scanner	Siemens Healthineers	no longer available	in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace	Siemens Healthineers		image analysis, alternative software: Pmod