Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup> 64</sup> Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em> In Vivo</em> Zellhandel von PET / CT
Summary
Nach der Herstellung eines 64 Cu-modifizierte monoklonale Antikörperbindung an einem transgenen Maus – T – Zell – Rezeptor, sind T – Zellen radioaktiv markiert in vivo, analysiert auf ihre Lebensfähigkeit, Funktionalität, Etikettieren Stabilität und Apoptose und adoptiv transferiert in Mäuse mit einem Atemweg Allergien vom verzögerten Typ Reaktion zur nichtinvasiven Bildgebung durch Positronen-Emissions-Tomographie / Computertomographie (PET / CT).
Abstract
Dieses Protokoll stellt die Herstellung von 64 Cu und die Chelator Konjugation / radioaktive Markierung eines monoklonalen Antikörpers (mAb) , gefolgt von murine Lymphozyten – Zellkultur und 64 Cu-Antikörper – Rezeptor der Zellen abzielen. In – vitro – Bewertung der radioaktive Markierung und nicht-invasiven in vivo – Zellverfolgung in einem Tiermodell einer Atemwegs verzögerten Typ Überempfindlichkeitsreaktion (DTHR) von PET / CT beschrieben.
Im Detail wird die Konjugation eines mAb mit dem Chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) gezeigt. Nach der Herstellung von radioaktivem 64 Cu, radioaktiver Markierung der DOTA-konjugierten mAb beschrieben. Als nächstes werden die Erweiterung der Hühnerovalbumin (COVA) -spezifische CD4 + Interferon (IFN) -γ-produzierende T – Helferzellen (COVA-TH1) und die anschließende radioaktive Markierung der Cova-TH1 – Zellen dargestellt. Verschiedene in vitro – Techniken werden zur Veranschaulichung der ef auszuwertenkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf den Zellen, wie die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluß, die Färbung auf Apoptose mit Annexin V für die Durchflusszytometrie und die Beurteilung der Funktionalität , die durch IFN-γ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Darüber hinaus ist die Bestimmung der radioaktiven Aufnahme in die Zellen und die Markierungsstabilität im Detail beschrieben. Dieses Protokoll weiter beschrieben, wie Zell Tracking-Studien in einem Tiermodell für einen Atemweg DTHR und daher durchzuführen, die Induktion von COVA-induziertem akuten Atemweg DHTR in BALB / c-Mäusen ist enthalten. Schließlich ist eine robuste PET / CT-Workflow inklusive Bildaufnahme, Rekonstruktion und Analyse vorgestellt.
Der Cu-64 – Antikörper – Rezeptor – Targeting – Ansatz mit nachfolgender Rezeptor – Internalisierung hohe Spezifität und Stabilität, reduzierte zelluläre Toxizität bereitstellt, und niedrigen Efflux Raten im Vergleich zu herkömmlichem PET-Tracer für die Markierung von Zellen, beispielsweise 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazon) (64-PTSM Cu). Schließlich ermöglicht unser Ansatz nicht-invasive in vivo Zellverfolgung durch PET / CT mit einem optimalen Signal-Rausch – Verhältnis für 48 Stunden. Dieser experimentelle Ansatz kann auf verschiedenen Tiermodellen und Zelltypen mit membrangebundenen Rezeptoren übertragen werden, die internalisiert werden.
Introduction
Nicht-invasive Zellverfolgung ist ein vielseitiges Werkzeug , Zellfunktion, Migration und Homing in vivo zu überwachen. Recent Zellverfolgung Studien haben sich auf mesenchymale 1, 2 oder Knochenmark stammende Stammzellen 3 im Rahmen der regenerativen Medizin, autologem peripherer weißer Blutzellen in einer Entzündung oder T – Lymphozyten in adoptiven Zelltherapien gegen Krebs 3, 4 konzentriert. Die Aufklärung der Wirkorte und die zugrunde liegenden biologischen Prinzipien der zellbasierten Therapien ist von großer Bedeutung. CD8 + zytotoxische T – Lymphozyten, genetisch chimäres Antigen – Rezeptor (CAR) oder T – Zellen tumorinfiltrierende Lymphocyten engineered (TILs) wurden in großem Umfang als der Goldstandard. Allerdings Tumor-assoziiertes Antigen-spezifische TH1 – Zellen haben sich als eine wirksame alternative Behandlungsoption 4, sein </ sup> 5, 6, 7.
Als wichtige Akteure bei der Entzündung, organspezifischen Autoimmunerkrankungen (zB rheumatoide Arthritis oder Asthma bronchiales), und Zellen von großen Interesse in der Krebsimmuntherapie, ist es wichtig , die zeitliche Verteilung und Referenzierung Muster von TH1 – Zellen zu charakterisieren. Nicht – invasive in – vivo – Bildgebung durch PET stellt eine quantitative, hochempfindliche Methode 8 Zellmigrationsmuster, in vivo Referenzierung und die Seiten der T – Zell – Antworten und die Aktion während der Entzündung, Allergien, Infektionen oder Tumorabstoßungs 9, 10, 11 zu untersuchen.
Klinisch 111 In-Oxin ist für Leukozyten – Szintigraphie für die Unterscheidung von Entzündung und Infektion 12, während 2-deoxy-2- (18 verwendet ,F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) wird für die Zell Tracking – Studien von PET 3, 13 verwendet. Ein wesentlicher Nachteil dieses PET – Tracer, jedoch ist die kurze Halbwertszeit des Radionuklide 18 F bei 109,7 min und der niedrigen intrazelluläre Stabilität , die Bildübertragung zu späteren Zeitpunkt nach der Adoptivzelle behindert. Für längerfristige in – vivo – Studien Zellverfolgung von PET, obwohl instabil in den Zellen, 64 Cu-PTSM häufig unspezifisch eingesetzt zu etikettieren Zellen 14, 15 mit minimierten nachteiligen Wirkungen auf T – Zell – Lebensfähigkeit und Funktion 16.
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur weiteren nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren und die Funktion eines T-Zell-Rezeptor (TCR) -spezifischen radiomarkierten mAb verwendet. Zunächst wird die Herstellung der Radioisotop 64 Cu, die Konjugation des mAb KJ1-26 mit the Chelator DOTA und die nachfolgenden 64 Cu-Radiomarkierungs gezeigt. In einem zweiten Schritt wird die Isolierung und Expansion von COVA TH1-Zellen von DO11.10 Spendermäusen und die radioaktive Markierung mit 64 Cu belasteten DOTA-konjugierten mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) werden im Detail beschrieben. Die Beurteilung der Aufnahmewerte und Ausströmen von Radioaktivität mit einem Dosiskalibrator und y-Zählung jeweils sowie die Bewertung der Wirkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und Funktionalität mit IFN- & gamma; ELISA vorgestellt . Für nicht-invasive in vivo – Zellverfolgung, das Hervorrufen von einem Maus – Modell von COVA-induzierter akuten Atemweg DTHR und Bildaufnahme von PET / CT nach dem adoptiven Zelltransfer beschrieben.
Darüber hinaus kann diese Kennzeichnung Ansatz zu verschiedenen Krankheitsmodellen, Maus-T-Zellen mit unterschiedlichen TCRs oder allgemeinen Zellen von Interesse mit membrangebundenen Rezeptoren oder Ausdruck mar übertragen werdenkers kontinuierlichen Membran Basiswert 17 pendelt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige und einfache Methode zum stabilen Zellen für in vivo – Tracking von PET radioaktive Markierung. Unter Verwendung dieses Verfahrens COVA-TH1 – Zellen, isoliert und in vitro aus Spendermäusen erweitert, könnte mit 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und dessen homing wurde in einem die pulmonalen und perithymic LNs als Gebiete von COVA Präsentation nachgeführt radiomarkiert wird COVA-induzierten akuten Atemweg DTHR.
Die Modifikatio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant sowie Natalie Altmeyer für die Unterstützung während der Experimente und Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung, die DFG durch den SFB685 (Projekt B6) und Fortuné (2309-0-0) unterstützt.
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
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