Yaşayan Hücreleri Mühendise Sentetik Biyoloji kullanarak That Programlanabilir Malzemelerle Arayüzü
Summary
Bu yazıda mühendislik hücreleri ve sentetik kontrol ve programlanabilir malzeme yüzeylerini işlemek için E. coli mühendislik enable işlevselleştirilmiş yüzeylerin geliştirilmesi için bir dizi protokol sunar.
Abstract
Biz mühendislik hücreler işlevsel yüzey malzeme özelliklerini kontrol sağlayan bir abiyotik-biyotik bir arayüz geliştirdik. E. coli hücrelerinin bir sentetik tasarlanmış suşu ve işlevselleştirilmiş ara yüzüne: Bu sistem, iki modül oluşturarak yapılır. Bu metinde yer alan, biz detay genetik moleküler klonlama stratejileri kullanarak E.coli suşu içinde seçilen davranışları mühendislik için bir protokol. Bir kimyasal uyarıcı maruz kaldığında kez geliştirilen bu suş biotin yüksek seviyelerde üretir. Buna ek olarak, hücre sentezlenmiş biyotin cevap verebilecek her biri iki farklı işlevselleştirilmiş yüzeyler oluşturmak için ayrıntılarıyla protokolleri. Birlikte ele alındığında, biz cansız yüzeylerde malzeme bileşimi ve montaj kontrol hücreleri mühendislik sağlayan bir bağlantılı, abiyotik-biyotik sistemi oluşturmak için bir metodoloji sunuyoruz.
Introduction
Burada, bir mühendislik hücre hattından bir kimyasal sinyali cevap verebilen bir programlanabilir alt tabakanın geliştirilmesi için prosedürler bildirmektedir. 1 Biz sentetik tasarlanmış Escherichia coli (E. coli) hücreler tarafından üretilen biyotin yanıt veren bir biyotin-streptavidin arayüz oluşturarak bunu. Daha önce, programlanabilir yüzeyler toksin tespiti 2 ve nokta-bakım teşhisi 3 savunma ve güvenlik için geniş bir uygulama yelpazesi için tasarlanmış edilmiştir. Programlanabilir yüzeyler sensörler ve aktüatörler olarak yararlı olabilir 4, onlar farklı çevresel zorluklara uyum yeteneği ile donatarak, "akıllı" hale getirilebilir. Bunun aksine, örneğin, E. coli gibi daha basit bir mikroorganizmalar doğal uyum ve karmaşık ve çoğu zaman, beklenmedik çözümlerle zorluklara yanıt yeteneğine sahiptir. Bu uyum E. sağladıkompleks gen ağları tarafından kontrol coli popülasyonları, maliyet-etkin bir kaynak aramaya, 5 katma değerli ürünler, 6 ve hatta güç mikro ölçekli robotik oluşturun. 7 programlanabilir yüzeylerin kullanımı ile yaşayan hücrelerin adaptif avantajlarını birleştirerek, farklı çevre koşullarına cevap verebilecek bir akıllı substrat oluşturabilirsiniz.
Sentetik biyoloji canlıların davranışlarını programlamak için araştırmacılara yeni yetenekler vermiştir. yeni gen düzenleyici ağları içeren hücrelerin mühendislik, araştırmacılar programlanmış bir dizi davranışı gösteren hücreleri tasarlayabilirsiniz. Temel araştırma ötesinde 8, 9, bu davranışlar gibi katma değerli ürünler malzeme düzeneğini kontrol ve biyolojik üretmek gibi uygulamalar için kullanılabilir. 10 Burada, sentetik biyoloji araçlarını kullanılan ayrıntılarıyla nasıl trindüksiyondan sonra biotin sentezleyen bir E. coli suşu disi. Bu soy, bir plazmid, pKE1-lacl-biyobalistik monte sınırlama enzimi klonlama yöntemleri kullanılarak geliştirilmiştir. E. coli K-12 MG1655 dönüştürülmüştür, bu plasmid, biyobalistik, biyotin sentezi için gerekli bir enzimin, yüksek seviyelerde ifade yeteneğine sahip hücrelerin endows. dönüştürülmüş hücreler izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ile teşvik ve bir biyotin ön, destiobiyotin (DTB) ile sağlanan zaman, biotin yüksek seviyelerde üretildi.
streptavidin, biyotin en bağlanma etkileşimi doğada bulunan güçlü kovalent olmayan bağlar biridir. örneğin, biyotin-streptavidin interaksiyonundan iyi karakterize edilmiş ve son derece biyoteknoloji kullanılan hem de. Bu yazının içinde 11 biz duygusu ve işlevsel yüzey hücre üretilen biyotin algılamak için biyotin-streptavidin etkileşimi kullanan iki strateji sunuyoruz. Biz"Dolaylı" ve "doğrudan" kontrol programları gibi bu zıt yüzeylere bakın. Dolaylı kontrol şeması, hücre üretilen biyotin konjuge ve bağlayıcı siteler streptavidin bir polistiren yüzey üzerine immobilize edilmiş biotin ile rekabet eder. Buna ek olarak, streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) ile konjuge edilir. HRP 3, 3 ', 5, 5'-tetrametilbenzidin (TMB), 450 nm (OD 450), spektral emicilik (yani, optik yoğunluk) miktarının izlenebilir bir optik sinyalin, 12 üretilmesi için değiştirir. Böylece, dolaylı kontrol düzeni araştırmacılar OD 450 sinyal attentuation izleyerek hücre üretilen biyotin ölçmek için sağlar.
doğrudan kontrol şeması bir malzeme yüzeyine doğrudan streptavidin hareketsiz hale ve bağlayıcı siteleri streptavidin için rekabet hücre üretilen biyotin ve biyotinile HRP izin vererek streptavidin-biotin olay patlatır. Yine,Hücre üretilen biyotin nispi seviyeleri, bir OD 450 sinyalinin ölçülmesi ile takip edilir.
Birlikte ele alındığında, mühendislikten geçirilen hücreler ve fonksiyonalize yüzeyler US canlı hücre ağları uyararak programlanabilir yüzey özelliklerini kontrol sağlar. Diğer bir deyişle, biz birlikte bu sistemleri birbirine bağlayarak bir mühendislik malzemesi arayüzü canlıların uyum ve güvenilirlik ve şartname yararlanır bir sistem oluşturduk.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz bir fonksiyonelleştirilmiş malzeme yüzeyi ile yaşayan mühendislik hücrelerin arayüz için yeni bir strateji sundu. Bu IPTG ile indüklenmiştir zaman biyotin yüksek seviyelerde sentez edebilme yeteneğine sahip olan bir hücre hattı geliştirilmesi ile gerçekleştirildi. biotin yüksek seviyeler daha sonra fonksiyonalize yüzeyini değiştirmek için kullanılabilir. Protokoller E.coli hücre hattını mühendis nasıl ve iki farklı fonksiyonalize yüzeyler oluşturmak için nasıl ayrıntılı. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar minnetle ABD Bilimsel Araştırma Hava Kuvvetleri Ofisi ödül FA9550-13-1-0108 destek kabul. Yazarlar ayrıca Virginia Politeknik Enstitüsü ve Devlet Üniversitesi'nde Kritik Teknoloji ve Uygulamalı Bilimler Enstitüsü'nde ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Research fon, ABD Donanma Araştırma Ofisi ödül N00014-15-1-2502 destek kabul Burs Programı, ödül sayısı 1.607.310.
Materials
| LB Broth, Miller | Fisher Scientific | 12-795-027 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP9744500 | |
| Carbenicillin | Fisher Scientific | BP26481 | |
| M9, Minimimal Salts, 5X | Sigma-Aldrich | M6030 | |
| Casamino Acids | Fisher Scientific | BP1424-100 | |
| Magnesium Sulfate, Anhydrous | Fisher Scientific | M65-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Dextrose (D-Glucose), Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| NEB Turbo Cell Line | New England Biolabs | C2984l | |
| Oligonucleotide Primers | Thermo Fisher Scientific | N/A | 25N synthesis, DSL purification |
| Q5 High-Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
| Q5 Reaction Buffer | New England Biolabs | B9027S | |
| dNTP Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| Agarose | Bioexpress | E-3120-125 | |
| Ethidium Bromide, 1% | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| Gel Extraction Kits | Epoch Biolabs | 2260250 | |
| GenCatch Plasmid DNA Miniprep Kit | Epoch Biolabs | 2160250 | |
| AatII | New England Biolabs | R0117S | |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | R3104S | |
| EcoRI-HF | New England Biolabs | R3101S | |
| Cutsmart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202S | |
| T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202S | |
| ColiRolle Glass Plating Beads | EMD Millipore | 7101-3 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | BP1755-10 | |
| NHS-Desthiobiotin (DTB) | Thermo Fisher Scientific | 16129 | |
| Succinimidyl Trans-4-(maleimidylmethyl) Cyclohexane-1-Carboxylate (SMCC) | Thermo Fisher Scientific | S1534 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Succinimidyl 3-(2-pyridyldithio) Propionate (SPDP) | Thermo Fisher Scientific | S1531 | |
| NHS-LC-LC-biotin | Thermo Fisher Scientific | 21343 | |
| Horseradish Peroxidase (HRP) | Thermo Fisher Scientific | 31490 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10X Solution | Fisher Scientific | BP399500 | |
| Streptavidin (SA) | Thermo Fisher Scientific | 21145 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 | |
| Ethylenediaminetetaacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Tween 80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | H325-4 | |
| 3, 3', 5, 5'-tetramethylbenzidine (TMB) | Fisher Scientific | AC229280050 | |
| Vivaspin 500 Centrifugal Concentrators | Viva Products | VS0192 | |
| Sodium Acetate, Anhydrous | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| 96-Well Polystyrene Plates | Thermo Fisher Scientific | 266120 |
References
- Zhang, R., Heyde, K. C., Scott, F. Y., Paek, S. -. H., Ruder, W. C. Programming Surface Chemistry with Engineered Cells. ACS Synth. Biol. , (2016).
- Zhou, X., et al. Reduced graphene oxide films used as matrix of MALDI-TOF-MS for detection of octachlorodibenzo-p-dioxin. Chem. Commun. 46, 6974-6976 (2010).
- Pardee, K., et al. Low-Cost Detection of Zika Virus Using Programmable Biomolecular Components. Cell. 165, 1255-1266 (2016).
- Bähring, S., et al. Design and Sensing Properties of a Self-Assembled Supramolecular Oligomer. Chem. Eur. J. 22, 1958-1967 (2016).
- Nicolau Jr, D. V., Armitage, J. P., Maini, P. K. Directional persistence and the optimality of run-and-tumble chemotaxis. Comp. Biol. Chem. 33, 269-274 (2009).
- Du, J., Shao, Z., Zhao, H. Engineering microbial factories for synthesis of value-added products. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 38, 873-890 (2011).
- Kim, H., Kim, M. J. Electric Field Control of Bacteria-Powered Microrobots Using a Static Obstacle Avoidance Algorithm. IEEE Trans. Rob. 32, 125-137 (2016).
- Gardner, T. S., Cantor, C. R., Collins, J. J. Construction of a genetic toggle switch in Escherichia coli. Nature. 403, 339-342 (2000).
- Heyde, K. C., Ruder, W. C. Exploring Host-Microbiome Interactions using an in Silico Model of Biomimetic Robots and Engineered Living Cells. Sci. Rep. 5, 11988 (2015).
- Rice, M. K., Ruder, W. C. Creating biological nanomaterials using synthetic biology. Sci. Tech. Adv. Mater. 15, 014401 (2014).
- Green, N. M. Avidin. 3. The nature of the biotin-binding site. Biochem. J. 89, 599-609 (1963).
- Mesulam, M. M. Tetramethyl benzidine for horseradish peroxidase neurohistochemistry: a non-carcinogenic blue reaction product with superior sensitivity for visualizing neural afferents and efferents. J Histochem. Cytochem. 26, 106-117 (1978).
- Litcofsky, K. D., Afeyan, R. B., Krom, R. J., Khalil, A. S., Collins, J. J. Iterative plug-and-play methodology for constructing and modifying synthetic gene networks. Nat. Meth. 9, 1077-1080 (2012).
- Gibson, D. G., et al. Complete Chemical Synthesis, Assembly, and Cloning of a Mycoplasma genitalium Genome. Science. 319, 1215-1220 (2008).
- Diamandis, E. P., Christopoulos, T. K. The biotin-(strept)avidin system: principles and applications in biotechnology. Clin. Chem. 37, 625-636 (1991).
- Nerurkar, L. S., Namba, M., Brashears, G., Jacob, A. J., Lee, Y. J., Sever, J., L, Rapid detection of herpes simplex virus in clinical specimens by use of capture biotin-streptavidin enzyme-linked immunosorbent assay. J. Clin. Micro. 20, 109-114 (1984).
- Cui, Y., Wei, Q., Park, H., Lieber, C. M. Nanowire Nanosensors for Highly Sensitive and Selective Detection of Biological and Chemical Species. Science. 293, 1289-1292 (2001).
