Summary

Generación de fusiones de proteínas fluorescentes en<em> Candida</em> Especies

Published: March 04, 2017
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Summary

La modificación genética mediada por PCR se puede utilizar para generar fusiones de proteínas fluorescentes en especies de Candida, lo que facilita la visualización y cuantificación de células de levadura y las proteínas. Aquí, se presenta una estrategia para la construcción de una fusión proteína fluorescente (Eno1-FP) en Candida parapsilosis.

Abstract

Las especies de Candida, colonizadores frecuentes de los tractos intestinal y genitourinario, son la causa de la mayoría de las infecciones fúngicas invasivas en seres humanos. Por lo tanto, se necesitan herramientas moleculares y genéticos para facilitar el estudio de sus mecanismos de la patogénesis. la modificación genética mediada por PCR es un método sencillo y rápido para generar proteínas etiquetadas con epítopo para facilitar su detección. En particular, la proteína fluorescente (FP) fusiones son herramientas poderosas que permiten la visualización y cuantificación de ambas células de levadura y las proteínas por microscopía de fluorescencia y la inmunotransferencia, respectivamente. Los plásmidos que contienen secuencias de codificación de PF, junto con los genes marcadores nutricionales que facilitan la transformación de las especies Candida, se han generado con el propósito de la construcción FP y expresión en Candida. Aquí, se presenta una estrategia para la construcción de una fusión FP en una especie de Candida. Los plásmidos que contienen el sold nourseothricinna vez que el gen marcador de transformación (NAT1) junto con secuencias para cualquiera verde, amarillo, o de cerezas FPS (GFP, YFP, mCherry) se utilizan junto con los cebadores que incluyen secuencias de genes específicos en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para generar un módulo de FP . Este casete de genes específicos tiene la capacidad de integrar en el extremo 3 'del locus del gen correspondiente a través de recombinación homóloga. El éxito de fusión en el marco de la secuencia de FP en el locus de gen de interés se verifica genéticamente, seguido por el análisis de la expresión de proteína de fusión por microscopía y / o métodos de inmunodetección. Además, para el caso de proteínas altamente expresados, fusiones exitosas pueden ser examinados para principalmente por técnicas de imagen de fluorescencia.

Introduction

Las especies de Candida son comensales hongos que colonizan el tracto intestinal y genitourinario de todos los seres humanos. En condiciones de inmunodeficiencia, tales como que se producen con el nacimiento prematuro o efectos inmunosupresores de los tratamientos para el cáncer, las especies de Candida pueden llegar a ser patógenos oportunistas. De las especies de Candida, Candida albicans es el colonizador fúngica más frecuente y causa la mayoría de las infecciones fúngicas invasivas. Otras especies de Candida, como C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis y C. También kruseii causan infecciones graves en pacientes inmunocomprometidos, con alguna resistencia intrínseca que presenta a los antibióticos comúnmente utilizados antifúngicos como fluconazol y anfotericina B. Por lo tanto, las infecciones con algunas de estas especies están siendo observados con mayor frecuencia, especialmente en pacientes que están siendo tratados profilácticamente con agentes anti-hongos. Incluso con una apropiada y oportunanti tratamiento de las infecciones fúngicas, infecciones invasivas por Candida continúan siendo asociado con morbilidad y mortalidad significativa 1. Debido a la importancia de especies de Candida en la salud humana, existe una necesidad de herramientas moleculares fácilmente disponibles que permiten el estudio y la elucidación de sus mecanismos de la patogénesis.

Una herramienta importante que permite a los investigadores visualizar y cuantificar las células microbianas y las proteínas que se expresan es la tecnología de fusión FP. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la modificación genética mediada, tal como se describe en este documento, permite la construcción de fusiones, entre las secuencias de PF y una proteína de Candida secuencia codificante de interés en su locus genómico. La integración estable de la construcción facilita el análisis de la expresión de proteínas, así como la dinámica de localización de proteínas. Los plásmidos que contienen secuencias de PF, optimizados para la expresión en Candida albicans y que se pueden utilizar en la g mediada por PCRestrategia de modificación eno, se han construido previamente 2, 3, 4, 5. Los plásmidos contienen FP transformación "casetes": una secuencia FP ligado a un gen marcador nutricional que facilita la transformación de C. albicans y C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. Actualmente plásmidos disponibles contienen una variedad de genes marcadores seleccionables nutricionales (URA3, His1, ARG4) para la transformación de las cepas auxotróficas, así como un marcador de resistencia dominante fármaco (NAT1), que facilita la transformación de cepas clínicas que carecen de auxotrophies. Además, los plásmidos que contienen opciones para hasta cuatro secuencias diferentes (FP verde [GFP], yellow [YFP], cian [PPC], y cereza [mCherry]) y, o bien una secuencia de terminación de ADH1 para la construcción de fusiones de proteínas carboxi-terminal, o una secuencia promotora para la construcción de fusiones de proteína amino-terminal. Los cebadores están diseñados con homología con el plásmido de ADN que rodea a la casete de FP. Además, los cebadores también contienen secuencias 5 'de extensión que llevan homología con el gen de levadura de interés para ser marcados, lo que facilita la integración del casete en el locus genómico mediante recombinación homóloga (Figura 1). Cassettes de PF de genes específicos son generados por PCR y luego se transformaron en células de Candida hechas competentes para la captación de ADN por tratamiento con acetato de litio.

Figura 1
Figura 1: Diagrama de cómo FP fusiones de secuencia se generan en las especies de Candida. (A) El ADN del plásmido INCLUYENDOes una secuencia FP y una secuencia que codifica resistencia nourseothricin (NAT1). ubicaciones relativas de Forward (FWD) y atrás primers (REV) se muestran, con partes negras de los cebadores que indica la región de homología con la secuencia del plásmido y las porciones de color púrpura que denotan la región de homología con el gen específico o extensión del cebador. Casetes (B) de PF se transforman en Candida y se integran dentro del locus genómico ENO1 mediante recombinación homóloga (líneas de puntos). (C) resultante secuencia de fusión FP al extremo 3 'de ENO1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Aquí, se presenta un ejemplo de construcciones de proteínas de fusión (Eno1-FP) en especies de Candida. Nos utilizan referencia de plásmidos que contienen el gen marcador de la transformación NAT1 junto con secuencias que codifican GFP, YFP, omCherry (Figura 2). Estos plásmidos se utilizan junto con cebadores en PCR para generar casetes de genes específicos que facilitan la fusión de los programas marco para el extremo 3 'de ENO1, lo que resulta en la expresión de Eno1 fusionado a programas marco en su extremo carboxi-terminal.

Figura 2
Figura 2: Mapas de los plásmidos que contienen cassettes-PF. Forward (F) y atrás primers (R) utilizados para generar los casetes de los plásmidos se indican junto con la ubicación relativa de su homología con los plásmidos. Las secuencias de cebador son como se indica en la Tabla 1. F1 y R1 también se utilizaron para generar el casete pYFP- NAT1. El plásmido que contiene el casete YFP- NAT1 (pMG2263) es idéntica a pMG2120 con la excepción de YFP en lugar de la secuencia de GFP. Los tamaños de casete: GFP-NAT1, 3,7 kbp; mCherry- NAT1, 3,2 kpb; YFP- NAT1, 3.7 kpb. Esta cifra ha sido modificado a partir de Gerami-Nejad, et al. 4 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Aislar Plantilla plásmidos de E. coli Crecer E. coli que contiene el plásmido de plantilla durante la noche en 10 ml de caldo de lysogeny (LB) + 200 mg / l de ampicilina (AMP) a 37 ° C con agitación. Cosecha células por centrifugación a 6.000 xg durante 2 min. Decantar líquido, aislar y purificar el ADN de células de E. coli por un método estándar como se describe anteriormente en Ausubel et al. 8. ADN resus…

Representative Results

Como ejemplo, se utilizó el protocolo descrito anteriormente para la construcción de GFP y mCherry fusiones a Eno1 en una cepa de C. parapsilosis laboratorio. Cada transformante putativo se volvieron a sembrar inicialmente para el crecimiento. En este ejemplo, ya que la proteína de fusión resultante es altamente expresado (enolasa) y los programas marco son brillantes, hemos sido capaces de detectar transformantes por microscopía de fluorescencia antes de realizar el diagn?…

Discussion

Construcción de epítopo etiquetado secuencias en las especies de Candida utilizando la estrategia de modificación del gen mediada por PCR descrito anteriormente se pueden resumir como un proceso de tres pasos. En primer lugar, un casete se hace por PCR que codifica tanto la secuencia deseada para la integración y regiones homólogas al locus de la inserción en el genoma de la levadura. En segundo lugar, las células de levadura para ser transformadas se hacen químicamente competente con acetato d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos a N. Dean para proporcionar la secuencia original mCherry FP, M. Gerami-Nejad para la construcción de plásmidos, B. Larson para la asistencia técnica, y T. Heisel útil para el asesoramiento durante el desarrollo de este proyecto. JB fue apoyado por el Premio del Consejo Europeo de Investigación Avanzada 340087 (RAPLODAPT). sistemas de microscopía e imagen fueron proporcionados por la Fundación Universidad de Minnesota Pediatría y la Universidad de Minnesota Centro de Imagen.

Materials

100W mercury lamp CHIU Technical Corporation M-100T
95% Ethanol Any NA
Adenine Any NA
Ampicillin Any NA
Carrier DNA Ambion AM9680 Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera Photometrics CoolSNAP HQ
Conical Tube Corning 430828 50ml
Culture Tube Rotator New Brunswick 2013923 TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade Any NA
Eppendorf Tubes Eppendorf 022363719, 022363212 0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask Fisher Scientific 7250089 125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Any NA
Freezer (-80 °C ) Thermo Electron Corporation ULT-1386-9-V Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets Chroma Technology Corporation 49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes Fisher Scientific 1496126 75mm
HRP goat anti-mouse antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody Santa Cruz Biotechnology SC-2301
Incubator (30 °C ) Any NA
Lithium Acetate Any NA
Lysogeny Broth (LB) Media Any NA
Magnesium Chloride Any NA
Microcentrifuge Eppendorf 5415 D
Microscope Nikon E600 Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody Roche 11814460001
Nourseothricin Fisher Scientific 50997939
PCR Thermocycler Applied Biosystems 9700 GeneAmp PCR System
PCR tubes BioExpress, GeneMate T-3035-1 0.2ml
Polyethylene Glycol 3350 Any NA
Potassium Chloride Any NA
Rabbit anti-mCherry antibody BioVision 5993-100
Refrigerator (4°C) Any NA
Sodium Acetate Any NA
Stereomicroscope Nikon SMZ1500
Table Top Centrifuge Labnet Z 400 Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase Any NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Any NA
Vortex Mixer Scientific Industries SI-0236 Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media Any NA

References

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Cite This Article
Gonia, S., Berman, J., Gale, C. A. Generation of Fluorescent Protein Fusions in Candida Species. J. Vis. Exp. (121), e55333, doi:10.3791/55333 (2017).

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