Моделирование рака яичников Многоклеточная Сфероид Поведение в микроустройство Dynamic 3D перитонеального
Summary
Для изучения прогрессии опухоли яичников в физиологически соответствующей модели, многоклеточные сфероиды культивировали в микроустройство в смоделированных потоке текучей среды. Эта динамическая 3D модель эмулирует внутрибрюшного среду с клеточными и механических компонентов, где происходит яичников раковых метастаз.
Abstract
Рак яичников характеризуется широким перитонеального метастазирования, с опухолевыми сферами обычно встречаются в злокачественных асцит. Это связано с плохими клиническими результатами и в настоящее время не хватает эффективного лечения. И трехмерные (3D) окружающая среда и динамические механические силы являются очень важными факторами в этом метастатического каскада. Тем не менее, традиционные клеточные культуры не Повторим этот естественный микросреды опухоли. Таким образом, в естественных условиях -как модели , которые могут эмулировать внутрибрюшной среды имеют очевидное значение. В этом исследовании, новая платформа Микрожидкостных брюшины была создана, чтобы имитировать ситуацию яичников сфероидов рака в брюшной полости во время метастазирования. Яичниковые сфероидов рака, сгенерированные под неприлипающими состоянии культивировали в микроканалов, покрытых перитонеального мезотелиальной клеток, подвергнутых физиологически соответствующего напряжения сдвига. Таким образом, эта динамика 3D-рак яичников Мезотелия микрофонrofluidic платформа может предоставить новые знания по основам биологии рака и служить в качестве платформы для потенциального скрининга и разработки лекарственных средств.
Introduction
Рак яичников является наиболее летальной гинекологический рак и характеризуется широко распространенной перитонеального распространения и образование злокачественных асцит 1. Эта обширная перитонеальный метастаз представляет собой серьезную клиническую проблему и связано с плохими клиническими результатами. В отличие от большинства твердых карцином, которые метастазируют через кровь, рак яичников, прежде всего, рассеивает в брюшную полость. Опухолевые клетки существуют как многоклеточные агрегаты / сфероиды в процессе метастазирования 2. Тот факт , что подвеска культура может обогатить овариальных стволовых рак / опухолевые инициирующие клетки далее предположить , что эти сфероиды могут быть связаны как с опухолевой агрессивностью и усиливается химиорезистентность 3, 4. Существуют различия в ответ наркотиков между 2D и 3D культур, которые , предположительно , имеют разные молекулярные механизмы 5.
_content "> Существенное взаимодействие с мезотелием создает первичный микросреду для прогрессии опухоли яичников. Эти мезотелиальной клетки лежат на внеклеточного матрикса (ЕСМ), где фибронектин является вездесущим компонентом. Связь между увеличением экспрессии мезотелиальной клеток, полученных фибронектина и прогрессирование опухоли было показано. фибронектина в изобилии присутствует в злокачественных асцит 6, 7. Яичниковые раковые клетки также способны индуцировать секрецию фибронектина из мезотелиальной клеток для того , чтобы способствовать раннему метастазирования рака яичников 8.Все новые данные показывают , что механические стимулы, в том числе напряжения сдвига, могут модулировать морфологии клеток, экспрессию генов, и, таким образом, фенотипы опухолевых клеток 9, 10, 11. Как злокачественного асцита развивать и накапливать в течение тumor прогрессии, овариальные опухолевые клетки подвергаются потока жидкости и в результате напряжения сдвига. Ряд групп, включая и наши, показали влияние напряжения сдвига на прогрессирование рака яичников, в том числе модификации цитоскелета, эпителиально-к-мезенхимальных переходы и стволовости 12 рака, 13, 14, 15. Таким образом, физиологически соответствующие микросреда имеет важное значение для исследования опухоли перитонеальные метастазы. Однако современные гидродинамические культурах клеток имеют ограничения на пародирование и контроль постоянной, низкий, физиологически соответствующее напряжение сдвига 16, 17, 18, 19. Обычные в пробирке подходы , ориентированные либо на клеточном или механической среде по – прежнему ограничены вимитируя сложность внутрибрюшинного микросреды с правильной физиологической значимости.
Вот для того, чтобы спроектировать новую модель брюшины, чтобы преодолеть ограничения традиционных стратегий и продвигать исследование внутрибрюшинного отделение в метастазирования рака, 3D Микрожидкостных на основе платформы с регулируемым потоком жидкости был разработан. В этой модели, овариальные сфероидов рака совместно культивировали с первичными перитонеальных мезотелиальных клеток человека в микрофлюидальных чипсов при непрерывном жидкостный поток (рисунок 1А). Мезотелиальной клетки высевали на фибронектином. Неприлипающие яичников сфероидов рака были посеяны в микроканалов с непрерывным потоком среды перфузируемом с помощью шприца. Оба 3D окружающей среды и динамические механические силы являются очень важными факторами, метастатического каскада. Эта платформа может быть использована для исследования внутрибрюшной микросреду с точки зрения комплексного CELlular и совместного взаимодействия культур, а также в отношении динамических механических сигналов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот анализ предлагает гибкую и физиологически соответствующую модель, которая может быть объединена с различными биохимическими и клеток на основе анализов, в том числе, но не ограничиваясь ими, анализов адгезии, мезотелиальной анализов очистки, а также скрининга лекарственных сред?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана исследовательских грантов Совета Гонконга (гранты 17122014, C1013-15G, 719813E и 17304514). АСТ Вонг является получателем Croucher старшего научного братства.
Materials
| Silicon wafer | University wafer | #1196 | 100mm |
| SU-8 2075 photoresist | Microchem | ||
| SU-8 developer | Microchem | 108-65-6 | |
| Trichloro (1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl) silane | Sigma | 448931 | |
| Sylgard 184 | Dow Corning | 1673921 | Polydimethylsiloxane (PDMS) + curing agent kit |
| Biopsy punch | Miltex | 33-31AA | 1 mm diameter |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Polyethylene tubing | SCI | BB31695-PE/5 | 0.86mm (inner diameter) |
| Syringe | Terumo | ||
| Syringe pump | Longer precision pump | LSP01-2A | |
| Medium 199 | Invitrogen | 31100-035 | Add 2.2g/L sodium bicarbonate |
| MCDB 105 Medium | Sigma | M6395 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30068.02 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Trypsin EDTA solution | Gibco | 25300-054 | 0.05% Trypsin -0.01% EDTA, phenol red |
| Fibronectin human | BD | 354008 | |
| Agarose | Invitrogen | 15510-027 | |
| 5-chloromethylfluorescein diacetate | Life technologies | C7025 | Green CMFDA |
| CO2 incubator | SANYO | MCO-18AIC | |
| Centrifuge | Hitachi | CT15RE | |
| Fluorescent microscope | Nikon | Model: 80i or ECLIPSE Ti; software: SPOT | |
| SKOV-3 | Gift from Dr. N Auersperg (University of British Columbia) |
References
- Jemal, A., et al. Global cancer statistics. CA: Cancer J. Clin. 61, 69-90 (2011).
- Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
- Chau, W. K., Ip, C. K., Mak, A. S., Lai, H. C., Wong, A. S. c-Kit mediates chemoresistance and tumor-initiating capacity of ovarian cancer cells through activation of Wnt/beta-catenin-ATP-binding cassette G2 signaling. Oncogene. 32, 2767-2781 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors. Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).
- Tang, M. K. S., Zhou, H. Y., Yam, J. W. P., Wong, A. S. T. c-Met overexpression contributes to the acquired apoptotic resistance of nonadherent ovarian cancer cells through a cross talk mediated by phosphatidylinositol 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase 1/2. Neoplasia. 12, 128-144 (2010).
- Ksiazek, K., et al. Senescent peritoneal mesothelial cells promote ovarian cancer cell adhesion: the role of oxidative stress-induced fibronectin. Am. J. Pathol. 174, 1230-1240 (2009).
- Hafter, R., Klaubert, W., Gollwitzer, R., Vonhugo, R., Graeff, H. Crosslinked Fibrin Derivatives and Fibronectin in Ascitic Fluid from Patients with Ovarian-Cancer Compared to Ascitic Fluid in Liver-Cirrhosis. Thromb Res. 35, 53-64 (1984).
- Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: An emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307, 58-62 (2005).
- Chang, S. F., et al. Tumor cell cycle arrest induced by shear stress: Roles of integrins and Smad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 3927-3932 (2008).
- Rutkowski, J. M., Swartz, M. A. A driving force for change: interstitial flow as a morphoregulator. Trends Cell Biol. 17, 44-50 (2007).
- Rizvi, I., et al. Flow induces epithelial-mesenchymal transition, cellular heterogeneity and biomarker modulation in 3D ovarian cancer nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 110, E1974-E1983 (2013).
- Ip, C. K., et al. Stemness and chemoresistance in epithelial ovarian carcinoma cells under shear stress. Sci. Rep. 6, 26788 (2016).
- Avraham-Chakim, L., et al. Fluid-flow induced wall shear stress and epithelial ovarian cancer peritoneal spreading. PloS one. 8, e60965 (2013).
- Burkhalter, R. J., et al. Peritoneal mechanobiology and metastatic success in epithelial ovarian cancer. Faseb Journal. 26, (2012).
- Lane, W. O., et al. Parallel-plate flow chamber and continuous flow circuit to evaluate endothelial progenitor cells under laminar flow shear stress. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
- Botta, G. P., Manley, P., Miller, S., Lelkes, P. I. Real-time assessment of three-dimensional cell aggregation in rotating wall vessel bioreactors in vitro. Nat. Protoc. 1, 2116-2127 (2006).
- Ismadi, M. Z., et al. Flow characterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell culture application. PloS one. 9, e106493 (2014).
- Yu, W., et al. A microfluidic-based multi-shear device for investigating the effects of low fluid-induced stresses on osteoblasts. PloS one. 9. 9, e89966 (2014).
