השיטה המוצגת כאן מתארת בפועל ייצור מדרגים טובים (GMP) מערכת בידול -ready לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם מתאי גזע פלוריפוטנטיים. היא משמשת חסכונית מערכת הסטנדרטית כדי לייצר תאי hepatocyte דמוי אדם למחקר כבד בסיסי ויישומי אדם.
תאי גזע פלוריפוטנטיים אדם (hPSCs) להחזיק ערך רב למחקר ביו. hPSCs וניתן לשנותם בדיל לכל סוגי התאים נמצאים בגוף האדם. הבידול של hPSCs לתאי hepatocyte דמוי אדם (HLCs) נחקר בהרחבה, ופרוטוקולי בידול יעילים הוקמו. השילוב של תאי מטריקס וגירויים ביולוגיים, כוללים גורמי גדילה, ציטוקינים, ומולקולות קטנות, הפך אותו ניתן להפיק HLCs דומה hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה. עם זאת, הרוב המכריע של הליכים עדיין להעסיק רכיבים בלתי מוגדרים, והוליד יצווה אל תצווה וריאציה. זה משמש כמחסום משמעותי ליישום של הטכנולוגיה. כדי להתמודד עם בעיה זו, פיתחנו מערכת מוגדרת לבידול hepatocyte באמצעות laminins רקומביננטי אנושי כמו מטריצות תאיים בשילוב עם תהליך התמיינות סרום ללא. מאוד מפרט hepatocyte ביותר הושג, עם דהmonstrated שיפור בתפקודי לבין פנוטיפ היא HLC. חשוב לציין, מערכת זו היא קלה בהיקף של עד באמצעות קווי hPSC מחקר GMP כיתה מקדמות מבטיח בדוגמנות מבוססת תאים וטיפולים.
רקמה אנושית ראשונית ואת סוגי תאי נגזרים משמשים באופן קבוע, הוא להקרנה מבוססת תאים ו במרפאת. עם זאת, גישת התאים אלה מוגבלים קשה בשל תרומת איברים מספיק ואובדן פנוטיפים תא פוסט-בידוד 1. hPSCs מייצג אלטרנטיבה מבטיחה לרקמות ראשוניות להקל על הדור של תאי סומטיים אדם גנטי מוגדרים ומתחדשים. תאי Hepatocyte דמוי (HLCs) נגזרים hPSCs כבר הראו הבטחה בתחום זה. HLCs להידמות hepatocytes אדם מן המעלה הראשונה בהיבטים שונים, כולל מורפולוגיה התא, ביטוי גנים hepatocyte, התפקוד המטבולי, ורגישות לתרופות ווירוסים 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. בנוסף, ריבוי ללא הגבלהקיבולת התחדשות עצמית של שני hPSCs שחוקר ו- GMP הכיתה הופכת לפשוט בקש 9, 10.
יותר מעשור של מחקר פיק מספר נהלי בידול hepatocyte היעיל 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. עם זאת, רוב המערכות הללו להשתמש ברכיבים מוגדרים ו / או תמרה ויראלית לנהוג מפרט hepatocellular. כדי לשפר את האמינות של הטכנולוגיה בקנה המידה, חשוב לפתח בידול hepatocyte חזקמערכת מוגדרת באמת ונטול קסנו, ו- GMP תואם.
Laminins (LNs) הם חלבוני מטריצה חשובים תאיים שיכול להשפיע הידבקות תא, התפשטות, הגירה, והבחנה. Laminins הם גליקופרוטאינים heterotrimeric מורכב α אחד, β אחד, ושרשרת γ אחד. לאחרונה, laminins אנושי רקומביננטי הופקו ומשמש בביולוגיה של התא. LN-511 הוכחו לתמוך התחזוקה של hPSCs 21, תוך תערובת של LN-521 ו- E-cadherin מאפשרת גזירה משובטת והרחבה בתאי גזע עובריים אנושיים 22. LN-111, מצד שני, תומך בשמירה על תאי hepatoblast דמוי נגזר hPSCs 23. עם זאת, לפני הדו"ח שלנו, laminins 521 ו -111 לא נוצלו כדי ליצור HLCs עם מאפיינים בוגרים מ hPSCs 10.
כאן, אנו הליכים פרט עבור culturing hPSCs על LN-521ומבדל אותם משני LN-521 או תערובת של LN-521 לבין LN-111 (LN-521 / LN-111). אנחנו מותאמים פרוטוקול הבידול באמצעות זריעה מתחיל מתא בודד ליצור בשכבה לשחזור הומוגנית מאוד של HLCs בפורמטים רבים 14. אנו מאמינים כי מערכת הבידול המוגדרת שלנו מייצגת שיטה פשוטה וחסכונית לייצר HLCs הפעיל עבור יישום, מייצג צעד משמעותי קדימה בתחום.
כדי לקדם את המחקר בתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם ורפואת translational, מערכות ללא קסנו אשר עולה בקנה אחד עם הנחיות ייצור נאותות נוכחיות נדרשות. המפתח לכל תהליך הבידול הוא תאי מטריקס (ECM). ה ECM לא רק תומך מצורף תא, אלא גם מספק גישה לגורמי איתות מפתח, המשפיע תא נחישות פנוטיפ 25, 26.
Laminins הם חלבוני מטריצה רבים תכליתיים תאיים in vivo. בכבד, הפרשת laminin היא קריטית עבור התחדשות כבדה לאחר כריתה חלקית 27 והוא נחוץ לצורך תחזוקת תאים ובתאים בכבדים 28. חשיבותה של laminins בתחזוקה כבדה והתחדשות הייתה הבסיס לבדיקה זמין מסחרי laminins האנושי רקומביננטי במערכת בידול hepatocyte שלנו.
Superior הואבידול patocyte הושג על LN-521 לבין LN-521 / LN-111 מצעים בהשוואת Matrigel. HLCs נגזר היו מקוטב ברורים ומאורגן בצלחת, ותפקוד הסלולר שלהם השתפר באופן משמעותי בהשוואה לעמיתיהם תערובת חלבונים הדביקים שלהם. ביסוד שיפורים אלו היה downregulation של זיהום colon-, fibroblast- גזע גנים הקשורים התא על laminins, כמו גם ירידה התפשטות תאים ו -10 ביטוי גנים הקשורים הגירה.
לסיכום, פרוטוקול המתואר כאן מייצר תאים דמויי hepatocyte שקרובות יותר באופיים hepatocytes אדם בוגרים. התהליך ניתן לשחזור, מקובל האוטומציה, והוא יכול להיות חסכוני מדורג עבור יישום. חשוב לציין, יצווה אל תצווה וריאציה כבר ירדה באופן משמעותי בהשוואה לטכניקות משתמשות Matrigel, וכתוצאה מכך מערכת בידול משופרת עבור חוקרים בתחום זה. </p>
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה עם פרסים מהפלטפורמה רפואה רגנרטיבית בבריטניה (MRC MR / L022974 / 1 ו MR / K026666 / 1) וכן מלגה סין.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |